SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4418—2016 出口食品中骆驼源性成分的检测 实时荧光PCR法 Detection of Camelus ingredient in exportfood-Real-time PCR method 行业标准信息服务平台 2016-03-09发布 2016-10-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4418—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院 本标准主要起草人：吴亚君、陈颖、杨艳歌、王斌、王嫂、刘鸣畅、韩建勋、黄文胜、邓婷婷。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4418—2016 出口食品中骆驼源性成分的检测 实时荧光PCR法 1范围 本标准规定了食品中骆驼源性成分的实时荧光PCR检测方法，可以对食品中骆驼源性成分进行定 性检测，在检测范围和技术指标方面可满足食品的检测需求。 本标准适用于乳品，新鲜、冷冻和加工的肉品中骆驼源性成分的定性检测。本标准所规定方法的最 低检出限（LOD)为0.01%（质量分数）。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403—2008 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 骆驼 camelus 偶蹄目骆驼科骆驼属，包括单峰骆驼和双峰骆驼。 3.1.2 实时荧光 PCRreal timePCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始 信息服务平台 模板的定量及定性分析。 3.1.3 Ct值cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid) dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate) CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide） Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris(Hydroxymethyl)aminomethane] EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid) 1 SN/T 4418—2016 Taq：水生栖热菌（Thermnsaquaticus) OD：光度密度（opticaldensity） Cytb：线粒体细胞色素b基因（cytochromeb） GH：生长激素基因（growth hormonegene) 4方法提要 提取DNA，采用骆驼的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR信号， 对食品中骆驼成分进行定性检测。 5试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均 用无DNA酶污染的容器分装。 5.1检测用引物和探针：骆驼源性成分扩增引物和探针、内参照引物和探针详见表1。骆驼引物扩增的 靶标序列参见附录A。 表1骆驼Cytb基因序列引物探针 物种名称 引物/探针序列（5'→3'） 扩增片段长度 靶基因 F:CCTCAGCAGGGTCTTCACCA 哺乳动物 R:TTCAGCTTCTCGTAGACNCG 66 bp GH （内参照） P:FAM-CAGCCTGGTGTTTGGCACCTCGGA-TAMAR F:ATTCTTYGCCTTCCAYTTCA R:AGCGTATGCGAAYAGGAART 骆驼 307 bp Cytb P:(FAM)-CCTACACGAAACAGGYTCTAATAACCCGAC-(TAMRA) 5.2 三氯甲烷(氯仿）。 5.3异丙醇。 pH8.0. 5.5CTAB沉淀液:5g/LCTAB,40mmol/L NaCl,pH8.0 5.6酚-三氯甲烷-异戊醇溶液：按照Tris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为25：24：1进行 配制。 5.7三氯甲烷-异戊醇溶液：按照三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为24：1进行配制 5.870%乙醇（体积分数）。 5.9NaCI溶液(1.2mol/L)。 5.10蛋白酶K(20mg/mL）。 5.11 实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U~2U(Unit，酶学单位）的Taq酶、 1XPCR buffer、2.5 mmol/L 的 Mg2+0.2 U UNG 酶、0.2 mmol/L 的 d(A,C,G)TPs、0.2 mmol/L dUTP、400nmol/LROX染料（某些荧光PCR仪不需要ROX校正）。 5.12 10XPCR缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl(pH8.4),200 mmol/L KCl,15 mmol/L MgCl2。 5.13 dNTP混合液。 2