ICS65.150 CCSB50 ZJSC 团 体 标 准 T/ZJSC2025—0024 中华鳖腮腺炎诊断方法 DiagnosticmethodsformumpsinChinesesoft-shelledturtle 2025-12-29发布 2026-01-29实施 浙江省水产学会  发布 全国团体标准信息平台 T/ZJSC2025—0024 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由浙江省水产学会提出并归口。 本文件起草单位：浙江省淡水水产研究所、浙江省农业科学院。 本文件主要起草人：张海琪、陈静、刘莉、姚嘉赟、袁雪梅、吕孙建、林锋、焦锦彪、郭琦。 全国团体标准信息平台 T/ZJSC2025—0024 1中华鳖腮腺炎诊断方法 1范围 本文件给出了中华鳖（PelodiscussinensisWiegmann，1834）腮腺炎诊断的缩略语、试剂和材料、 仪器设备，描述了临床症状、样品采集、解剖学及组织病理检查、病原菌分离及形态观察、细菌PCR检 测、病毒套式RT-PCR检测以及综合判定的方法。 本文件适用于中华鳖腮腺炎的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T28630.4 白斑综合征（WSD）诊断规程第4部分：组织病理学诊断方法 SC/T7011.1 水生动物疾病术语与命名规则第1部分：水生动物疾病术语 SC/T7011.2 水生动物疾病术语与命名规则第2部分：水生动物疾病命名规则 3术语和定义 SC/T7011.1和SC/T7011.2界定的术语和定义适用于本文件。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（basepair） cDNA：互补DNA（complementaryDNA） DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） dNTPs：脱氧核苷三磷酸混合物（deoxy-ribonucleotidetriphosphatemixture） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid） Oligo(dT)15：15个胸腺嘧啶组成的寡聚核苷酸 PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） RNA：核糖核酸（ribonucleicacid） RT-PCR：逆转录PCR（reversetranscriptionPCR） TaqDNA聚合酶：水生栖热菌DNA聚合酶（thermusaquaticusDNApolymerase） TSA：胰酪大豆胨琼脂（tryptic(trypticase)soyagar） TSB：胰酪大豆胨肉汤（trypticsoybroth） TSHSV：中华鳖出血综合征病毒（Trionyxsinensishemorrhagicsyndromevirus） 5试剂和材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 5.1琼脂糖：电泳级，常温保存。 全国团体标准信息平台 T/ZJSC2025—0024 25.2电泳核酸染料：溴化乙锭或其他等效试剂，- 20 ℃保存。 5.3DNA分子质量标准溶液：MarkerDL2000，- 20 ℃保存。 5.4MgCl2（25 mmol/L）：- 20 ℃保存。 5.5dNTPs（10 mmol/L）：含dATP、dTTP、dGTP和dCTP各2.5 mmol/L的混合物，- 20 ℃保存。 5.6TaqDNA聚合酶（5 U/L）：- 20 ℃保存。 5.710 × PCR缓冲液（无Mg2+）：随TaqDNA聚合酶提供，- 20 ℃保存。 5.86 ×载样缓冲液：室温保存。 5.95 × M-MLV逆转录酶缓冲液：商品化试剂，- 20 ℃保存。 5.10M-MLV逆转录酶（200 U/L）：商品化试剂，- 20 ℃保存。 5.11RNA酶抑制剂（40 U/L）：商品化试剂，- 20 ℃保存。 5.12TRIzoL试剂：商品化试剂，4 ℃保存。 5.13氯仿：分析纯，常温保存。 5.14无水乙醇：分析纯，常温保存。 5.15异丙醇：分析纯，常温保存。 5.16Oligo(dt)15（50μmol/L）：商品化试剂，- 20 ℃保存。 5.17TSA培养基：按A.1配制。 5.18TSB培养基：按A.2配制。 5.1975%乙醇：按A.3配制。 5.20EDTA（0.5 mol/L，pH8.0）：按A.4配制。 5.211 × TAE电泳缓冲液：按A.5配制。 5.22引物HPBc-F：5’-CTACAGGTCGCAGATAAAACAGTC-3’； 引物HPBc-R：5’-GCAAGGGCTAAAAATGAAATCT-3’； 引物TSHSV-hp2-F1：5’-ACCAGGATCATGGCCCACCTAC-3’； 引物TSHSV-hp2-R1：5’-TTCTTGGCAACATCGGCTTTCT-3’； 引物TSHSV-hp2-F2：5’-GGGGACTGCTGGAACTCTATTA-3’； 引物TSHSV-hp2-R2：5’-GTTTGGACCAGAAAGGTGAATG-3’。 5.23阳性对照：受蜡样芽孢杆菌感染的鳖组织样品，用于细菌PCR检测；受中华鳖出血综合征病毒 （TSHSV）感染的鳖组织样品，用于病毒套式RT-PCR检测。 5.24阴性对照：未受蜡样芽孢杆菌感染的鳖组织样品、未受TSHSV感染的鳖组织样品。 5.25空白对照：无菌双蒸水。 6仪器设备 6.1恒温培养箱。 6.2切片机。 6.3组织脱水机。 全国团体标准信息平台 T/ZJSC2025—0024 36.4包埋机。 6.5染色机。 6.6展片水浴锅。 6.7平板烘片机。 6.8封片机。 6.9水平电泳仪。 6.10普通PCR仪。 6.11摇床。 6.12紫外观察仪或凝胶成像仪：波长范围280 nm ～ 320 nm。 6.13光学显微镜。 6.14高速冷冻离心机：转速12000 rpm以上。 6.15微量移液器。 6.16生物安全柜。 7临床症状 发病前期病鳖表现出行动迟缓，食性下降发病后期可见病鳖多趴在岸边，脖子肿胀，软弱无力，在 水面游动时左右摇摆，形似“摇头”，严重时病鳖口鼻出血，部分病鳖底板发红，见B.1。 8样品采集 8.1采样对象 稚鳖、幼鳖、成鳖等。 8.2采样部位 无菌采集脾脏、肝脏、肾脏、肺和肠道组织样品。 8.3采样数量 具有临床症状的幼鳖或成鳖采3只～5只；稚鳖、无临床症状的幼鳖或成鳖采8只～10只。 8.4保存和运输 做组织病理检查的鳖样应活体送达实验室，及时取样检测；不做组织病理检查的鳖样，应活体或冰 鲜24 h内送达实验室。采样应加贴标签，标签上清楚标明样品编号、采样时间、采样地点。 9解剖学及组织病理检查 9.1样品处理和观察 将纱布浸75%乙醇后，覆盖于病鳖表面，或用含75%乙醇的棉球擦拭。针对幼鳖和成鳖，无菌解剖鳖 背甲，观察鳖口咽腔及内脏；取肝脏、脾脏、肾脏和肠道组织，迅速切成厚度不超过3 mm的组织块，按 GB/T28630.4的方法进行组织固定、脱水、石蜡包埋、切片、苏木精染色和伊红染色、封片，并置于光 学显微镜下观察。鳖腮腺炎解剖学特征示例见B.2和B.3，组织病理特征示例见B.4。 9.2结果判定 全国团体标准信息平台 T/ZJSC2025—0024 4若观察到解剖学特征表现为口咽腔红肿，内脏充血明显，肝脏有花斑样淤血点；或肝脏无花斑样淤 血点，但组织病理学特征表现为大量细菌在肝脏和脾脏中聚集，判定为疑似鳖腮腺炎。 10病原菌分离及形态观察 10.1病原菌分离和培养 用接种环或接种针（无菌）取鳖的脾脏、肝脏、肾脏、肺组织，分别划线接种于TSA培养基上，倒 置于恒温培养箱30 ℃± 1 ℃培养8 h ～ 12 h。 10.2结果判定 若观察到TSA培养基上可见形态一致，圆形乳白色凸起，融蜡状，表面光滑，边缘清晰整齐的菌落， 判定为疑似鳖细菌性腮腺炎。 11细菌PCR检测 11.1组织DNA提取 无菌取100 mg ～ 300 mg内脏组织放入无菌的研钵中，加入适量液氮研磨至粉状。将研磨后的样品转 移放入2 mL离心管中，加入700μL的2%CTAB抽提缓冲液，混匀后在65 ℃条件下水浴2 h，加入700μL氯 仿-异戊醇（体积比24 : 1），12000 r/min离心10 min，转移上清液至新的1.5 mL离心管中，加入2倍体 积预冷异丙醇，充分混匀后12000 r/min离心5 min，得到DNA沉淀。用500μL75%乙醇洗涤DNA沉淀，12000 r/min离心5 min，弃乙醇，重复操作2次，在室温干燥5 min，使乙醇挥发干净，加入100μL无菌超纯水 溶解DNA沉淀，- 20 ℃保存备用。提取过程同时设置阳性对照（感染蜡样芽孢杆菌的鳖组织样品）、阴 性对照和空白对照。也可采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化DNA提取试剂盒。 11.2PCR扩增 在冰盒上配制50μLPCR反应体系。在PCR反应管中加入：无菌水31.75μL、10 × PCR缓冲液5μL， dN