ICS65.150 CCSB50 ZJSC 团 体 标 准 T/ZJSC2025—0023 中华鳖黄病毒病诊断方法 DetectionprotocolsforTrionyxsinensisflavivirusdisease 2025-12-29发布 2026-01-29实施 浙江省水产学会  发布 全国团体标准信息平台 T/ZJSC2025—0023 前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由浙江省水产学会提出并归口。 本文件起草单位：浙江省淡水水产研究所、浙江省农业科学院。 本文件主要起草人：袁雪梅、张海琪、刘莉、姚嘉赟、陈静、焦锦彪、吕孙建、郭琦。 全国团体标准信息平台 T/ZJSC2025—0023 中华鳖黄病毒病诊断方法 1 范围 本文件给出了中华鳖黄病毒病诊断方法的缩略语、试剂和材料、仪器和设备，描述了临床症状，规 定了采样要求、RNA提取、RT-PCR检测、RT-qPCR检测和综合判定的方法。本文件适用于中华鳖黄病毒 的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 SC/T7011.1 水生动物疾病术语与命名规则第1部分：水生动物疾病术语 SC/T7011.2水生动物疾病术语与命名规则第2部分：水生动物疾病命名规则 T/ZJSC0013-2025沼虾黄病毒检测方法 3 术语和定义 SC/T7011.1和SC/T7011.2界定的术语和定义适用于本文件。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BHQ1：淬灭剂（blackholequencher1） bp：碱基对（basepair） Ct值：阈值循环数，即实时荧光定量PCR检测中荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 （cycle-thresholdvalue） DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylPyrocarbonate） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸混合物（deoxy-ribonucleosidetriphosphatemixture） EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) FAM：羧基荧光素（carboxyfluorescein） M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） RT-PCR：逆转录PCR（reversetranscriptionPCR） RT-qPCR：实时荧光RT-PCR（reversetranscriptionquantitativereal-timePCR） TaqDNA聚合酶：水生栖热菌DNA聚合酶（ThermusaquaticusDNApolymerase） TSFV：中华鳖黄病毒（Trionyxsinensisflavivirus） 5 试剂和材料 本文件中所有化学试剂，除非另有规定，仅使用分析纯试剂；水为符合GB/T6682中规定的一级 水。 5.1 DEPC：4 ℃保存。 全国团体标准信息平台 T/ZJSC2025—0023 5.2 TRIzol试剂：商品化试剂，4 ℃保存。 5.3 dNTPs (各2.5 mmol/L)：商品化试剂，- 20 ℃保存。 5.4 5 × M - MLV逆转录酶缓冲液：商品化试剂，- 20 ℃保存。 5.5 M - MLV逆转录酶(200 U/L)：商品化试剂，- 20 ℃保存。 5.6 RNA酶抑制剂(40U/L)：商品化试剂，- 20 ℃保存。 5.7 随机引物Randomprimers(500ng/L)：商品化试剂，- 20 ℃保存。 5.8 10 × PCR缓冲液(无Mg2+)：商品化试剂，- 20 ℃保存。 5.9 75%乙醇：按A.1配制。 5.10 EDTA (0.5mol/L，pH8.0)：按A.2配制。 5.11 50 × TAE电泳缓冲液：按A.3配制。 5.12 1 × TAE电泳缓冲液：按A.4配制。 5.13 MgCl2 (25 mmol/L)：商品化试剂，- 20 ℃保存。 5.14 TaqDNA聚合酶(5 U/L)：商品化试剂，- 20 ℃保存。 5.15 琼脂糖：电泳级。 5.16 核酸染料：商品化试剂，4 ℃保存。 5.17 DNAMaker：商品化试剂，- 20 ℃保存。 5.18 TSFVPCR引物：引物浓度为10 µmol/L，- 20 ℃保存。PCR引物分别是TSFV598-F和TSFV598-R， 扩增TSFV多聚蛋白基因中的598bp片段（见附录B.1）。引物序列如下： a)TSFV598-F：5′-CCTCAGAGACAGTGAAGAGGTGATAA-3′； b)TSFV598-R：5′-GCCATGTTCATTGGCTACAAC-C-3′； 5.19 TSFV荧光定量PCR引物：引物浓度为10µmol/L，-20 ℃保存。扩增引物分别是TSFV-Tq106F和 TSFV-Tq106R，扩增TSFV多聚蛋白基因中的106bp片段，探针TSFV-TqMAN（见附录B.2）。引物、探针 序列如下： a)TSFV-Tq106F：5′-AGGAACCAGAGCGTACAGAGAA-3′； b)TSFV-Tq106R：5′-CACCACAAACACTCCCAATGT-3′； c)TSFV-TaqMAN：5′-6-FAM-ACTGCTGCAAGTGCTATTGTCACTCCTBHQ1-3′。 5.20 阳性对照为确定感染TSFV的中华鳖组织样品，-80℃保存。 5.21 阴性对照为确定未感染TSFV的中华鳖组织样品，-80℃保存。 5.22 空白对照为DEPC水。 6 仪器设备 6.1 PCR仪。 6.2 荧光定量PCR仪：具有FAM荧光检测通道。 6.3 水平电泳仪。 6.4 紫外观察仪或凝胶成像仪：波长范围280 nm ～ 320 nm。 6.5 低温高速冷冻离心机：4 ℃，转速> 12000 r/min。 6.6 水浴锅或金属浴。 全国团体标准信息平台 T/ZJSC2025—0023 6.7 普通冰箱。 6.8 - 80 ℃超低温冰箱。 6.9 微波炉。 6.10 微量移液器。 7 临床症状 患病鳖腹部肿胀，部分出现底板发红、咳血、腹水充盈的症状。参见附录C。 8 样品采集 8.1 采样对象 稚鳖、幼鳖或成鳖。 8.2 采样数量 具有临床症状的鳖采3只～ 5只；无临床症状的鳖采8只～ 10只。鳖样品运送至实验室，活体及 时取样。 8.3 采样部位 采集肝脏、脾脏、肾脏和肺等组织。对于只能用非致死性方式取样的亲鳖，可采集血液。 9 RNA提取 按T/ZJSC0013-2025的规定执行。 10 RT-PCR检测 10.1 cDNA合成 按T/ZJSC0013-2025的规定执行。也可采用等效的商品化cDNA合成试剂盒，或在10.2中采用等效的 商品化一步法RT-PCR试剂盒，省略cDNA合成步骤。 10.2 PCR扩增 按照表1的要求，加入除TaqDNA聚合酶以外的各项试剂，在冰盒上配制成预混物，保存于- 20 ℃。 临用前，加入相应体积的TaqDNA聚合酶，混匀，按24 L/反应分装到PCR管中，然后分别加入1 L10.1 步骤合成的cDNA。置于PCR仪中，按以下程序进行PCR扩增：95 ℃5 min；94 ℃30 s、58 ℃30 s、68 ℃ 20 s，30个循环；68 ℃5 min，最后4 ℃保存。也可采用等效的商品化PCR试剂盒或一步法RT-PCR试剂盒。 表1 单个PCR反应预混物配制 试剂 体积/L 试剂终浓度 10 × PCR缓冲液（无Mg2+） 2.50 1 × PCR缓冲液 MgCl2（25 mmol/L） 2.00 2.00 mmol/L dNTPs（各2.5 mmol/L） 2.00 200 mol/L TSFV598-F和TSFV598-R（10µmol/L） 各0.50 0.20 mol/L 灭菌双蒸水 16.0 － TaqDNA聚合酶（5 U/L） 0.50 0.1 U/L 全国团体标准信息平台 T/ZJSC2025—0023 表1（续） 10.3 琼脂糖凝胶电泳 按T/ZJSC0013-2025的规定执行。如果观察到预期大小扩增片段，对PCR扩增产物进行测序，并 对测序结果进行序列比对。 10.4 结果判定 10.4.1 阳性对照在598 bp处应有一条特定条带出现；阴性对照在598 bp处应无条带出现，空白对照 不出现任何条带，实验有效。阳性对照在598bp处无特定条带出现或阴性对照在598 bp处有条带出现 都表明PCR失败，应在排除故障和清除污染后，重新取样检测。 10.4.2 检测样品在598 bp处有条带，且PCR产物测序结果符合参考序列（参见附录B.1），判为TSFV PCR结果阳性；检测样品在598 bp处无条带，判为TSFVPCR结果阴性。 11 RT-qPCR检测 11.1 cDNA合成 按10.1操作。 11.2 反应体系 按照表2的要求，在冰盒上配制成qPCR预混物，混匀后，按24L/反应分装到PCR管中，然后分别