ICS65.150 CCSB50 ZJSC 团 体 标 准 T/ZJSC2025—0022 大黄鱼5种细菌性病原快速检测环介导 等温扩增微流控芯片法 Rapiddetectionoffivebacterialpathogensinlargeyellowcroak-Loop mediatedisothermalamplificationintegratedmicrofluidicchipmethod 2025-12-29发布 2026-01-29实施 浙江省水产学会  发布 全国团体标准信息平台 T/ZJSC2025—0022 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由浙江省水产学会提出并归口。 本文件起草单位：宁波大学、浙江省海洋水产养殖研究所。 本文件主要起草人：陈炯、周前进、闫茂仓、聂力、王瑶华、陈琛。 全国团体标准信息平台 T/ZJSC2025—0022 1大黄鱼5种细菌性病原快速检测环介导等温扩增微流控芯片法 1 范围 本文件规定了大黄鱼5种细菌性病原快速检测的环介导等温扩增微流控芯片法的原理、材料和试剂、 仪器和设备、检测步骤、结果判定、生物安全要求。 本文件适用于大黄鱼变形假单胞菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、恶臭假单胞菌5种致病 菌的快速检测。其他水生动物可参照执行。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB4789.7 食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室生物安全通用要求 GB/T27401 实验室质量控制规范动物检疫 GB/T41521 多指标核酸恒温扩增检测微流控芯片通用技术要求 SN/T4624.17 入境环保用微生物菌剂检测方法第17部分：恶臭假单胞菌 SN/T5336 猪瘟病毒及非洲猪瘟病毒检测微流控芯片法 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid） FEN：结构特异性核酸内切酶（flapstructure-specificendonuclease） LAMP：环介导等温扩增（loopmediatedisothermalamplification） Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷-盐酸（tris（hydroxymethyl）aminomethane-hydrochloricacid） 4 原理 选取5种病原菌的特征性基因（gyrB、ompK、vhhA、TL和oprD）作为靶标，设计LAMP引物并预包埋 于微流控芯片反应池中。提取自样品的DNA，与LAMP反应液混合，加入芯片并密封，通过微流控芯片核 酸检测仪在恒温扩增条件下完成反应，并实时监测荧光信号。目标核酸若存在，扩增产物与荧光染料结 合后形成典型S型荧光曲线。根据曲线变化趋势，判定样本中是否含有相应病原菌。 5 材料和试剂 5.1 材料 5.1.1 微流控芯片：4×8离心式微流控芯片，5μL/反应池。 全国团体标准信息平台 T/ZJSC2025—0022 25.1.2 其他耗材：热封膜、封口膜（应符合SN/T5336）；无核酸污染的移液器吸头（10μL、200μ L、1000μL）、无核酸污染的离心管（1.5mL、2mL）等。 5.2 试剂 本文件中所有化学试剂，除非另有规定，仅为分析纯试剂。 5.2.1 实验用水符合GB/T6682要求的一级或二级水。 5.2.2 3％氯化钠碱性蛋白胨水（见附录B）。 5.2.3 核酸提取试剂，包括抽提缓冲液、20mg/mL蛋白酶K、Tris饱和酚、10mol/L乙酸铵、Tris-EDTA 缓冲液（见附录B），或使用等效的商品化试剂盒。 5.2.4 引物：每套LAMP引物，包括100μmol/LF3、100μmol/LB3、200μmol/LFIP、200μmol/L BIP，可包括200μmol/LLF和/或200μmol/LLB（见附录A）。合成后的F3、B3、LF、LB经聚丙烯酰 胺凝胶电泳（PAGE）纯化，FIP和BIP纯化使用高效液相色谱（HPLC）。 5.2.5 阴性对照、阳性对照、内参对照。 a)阴性对照：从未感染目标病原的大黄鱼组织提取的核酸； b)阳性对照：从感染目标病原的大黄鱼组织提取的核酸或人工合成的含有目标核酸序列的DNA片段； c)内参对照：含非病原序列的质粒与配套引物。内参质粒和引物预置于芯片反应池中。 5.2.6 LAMP反应试剂：20 mmol/LTris-HCl（pH8.8），10 mmol/LKCl，10 mmol/L(NH4)2SO4，8 mmol/L MgSO4，0.1%（v/v）吐温-20，1.4 mmol/LdNTPs，8000 U/mLBstDNA聚合酶，0.5 mg/mLFEN，50 μmol/L SYBRGreenI，内参质粒（100 copies/μL）。亦可使用经验证的等效的商品化的LAMP反应试剂盒。 6 仪器和设备 6.1 微流控芯片核酸检测仪。 6.2 高速离心机：能够降低至4 ℃，最大转速可达12000 rpm 6.3 天平：感量0.01 g。 6.4 恒温金属浴或水浴锅：100 ℃± 1 ℃。 6.5 低温冰箱：- 20 ℃。 6.6 控温摇床：- 15 ℃～ 80 ℃，± 0.1 ℃；能满足转速180 rpm ～ 220 rpm，振幅择20 mm ～ 25 mm（回 旋式）。 6.7 移液器：量程：0.5 μL ～ 10 μL、10 μL ～ 100 μL、100 μL ～ 1000 μL。 6.8 无菌II级生物安全柜。 7 检测步骤 7.1 样品采集与准备 应符合GB4789.7的规定。 7.2 细菌基因组DNA提取 7.2.1 增菌 应按照GB4789.7的规定执行。 7.2.2 使用煮沸法提取细菌基因组DNA a)用1.5 mL无菌离心管新制备的增菌液1 mL，10000 rpm离心1 min，弃上清液。 全国团体标准信息平台 T/ZJSC2025—0022 3b)细菌沉淀加入1 mL无菌水，充分悬浮沉淀，10000 rpm离心1 min，弃上清液。 c)加入100 μL无菌水，充分悬浮沉淀后，放入沸水浴10 min，迅速置于冰水中冷却5 min。 d)菌体混悬液，混匀后，再次放入沸水浴10 min，迅速置于冰水中冷却。 e)12000 rpm离心2 min ～ 3 min，收获上清即为细菌DNA模板。也可采用等效的商品化DNA提取试剂 盒并按其说明提取DNA。 7.2.3 使用有机溶剂提取法提取细菌基因组DNA 应按SN/T4624.17的规定执行。 7.3 大黄鱼组织DNA提取 a)约 50 mg组织样品，加入抽提缓冲液500 μL，充分研磨，37 ℃温浴1 h。 b)加入2.5 μL20 mg/mL的蛋白酶K，充分混匀后50 ℃3 h，间接性颠倒混匀。 c)将溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，颠倒混匀10 min，10000 rpm离心5 min，分离水 相和有机相。 d)水相移至新的1.5 mL离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25 : 24 : 1），颠倒混匀10 min， 10000 rpm离心1 min分离水相和有机相。 e)水相移至新的1.5 mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24 : 1），颠倒混匀10 min，10000rpm 离心1 min分离水相和有机相。 f)水相移至新的1.5 mL离心管中，加入100 μL10 mol/L乙酸铵，混匀后，再加入2倍体积（- 20 ℃） 预冷的无水乙醇混匀，- 20 ℃静置2 h。10000 rpm离心10 min，弃上清液。 g)70%乙醇洗涤沉淀2次，每次10000 rpm离心5 min，弃上清液。无色透明的DNA沉淀于室温晾干。 h)加入100μL灭菌的无菌水溶解DNA，备用，或者溶解于100μL灭菌的TE缓冲液并保存于- 20 ℃。 i)同等抽提效果的其他方法或使用商品化DNA抽提试剂盒。 7.4 微流控芯片检测 7.4.1 微流控芯片的制作 a)微流控芯片的制作应符合GB/T41521的规定。 b)引物预混：引物按照如下比例进行预混：F3 : B3 : FIP : BIP : LF : LB = 1 : 1 : 4 : 4 : 1 : 1，统 一稀释1000倍，充分混匀，形成引物预混液。若检测过程中，不使用LF或LB，用等体积的不含DNA的无 菌水替代。 c)引物包埋：在无菌Ⅱ级生物安全柜内，使用移液器将10 μL引物预混液精准滴加至微流控芯片 的指定反应池中，每个反应池对应一个特定靶基因。完成点布后，于室温下自然干燥约30 min。干燥完 成后，使用热封膜进行封装，制备成微流控芯片。 注：用于内参对照的质粒与其配套引物同步滴加至预设的内参反应池中。 7.4.2 反应体系配制 25 μL反应体系，包括LAMP反应试剂14.8 μL、DNA模板2 μL ，余量以无菌水补足。将各组分加入 1.5 mL离心管，涡旋混匀后瞬时离心。 7.4.3 加样与封片 将配制的反应体系全部加入到微流控芯片的加样孔，用封口