SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4417—2016 常见食品过敏原可视芯片检测方法 Food allergen detection with visual biosensor chips 行业标准信息服务平台 2016-03-09发布 2016-10-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4417—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共 和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验 检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：陈颖、韩建勋、王玮、邓婷婷、高宏伟、曾静、吴亚君、曹际娟、张舒亚、李志勇、 侯丽萍。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4417—2016 常见食品过敏原可视芯片检测方法 1范围 本标准规定了食品中大豆、花生、小麦、腰果、牛、鱼、鸡、虾等8种常见食品过敏原成分的可视芯片 检测方法。 本标准适用于检测糕点、巧克力等食品中8种食品过敏原成分的定性检测，其他食品可参照使用。 本标准所规定方法的最低检出限（LOD)为0.01%（质量分数）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 食品过敏原foodallergen 食品中能使机体产生过敏反应的物质。常见食品过敏原主要包括大豆、花生、小麦、坚果、牛奶、鱼、 蛋类及甲壳纲动物等八大类重要过敏原。 3.1.2 可视芯片visual biosensor chips 在平滑的基片表面均匀包覆一层100nm～1000nm厚度的透明薄膜，并将捕获探针以矩阵的形 式点样于活化的薄膜表面，即成为可视芯片。用生物素标记的样品核酸与芯片上捕获探针进行特异性 杂交反应，然后加入酶-抗体复合物和酶底物溶液。在酶的催化下，芯片表面的探针点上原位沉积产生 不溶物，引起薄膜表面厚度改变，继而导致探针点反射光的颜色改变，产生肉眼可见的杂交信号，完成样 息服务平台 品检测。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid) dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate) CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide)） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane] EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid) Taq：水生热栖菌（Thermusaquaticu） OD：光密度值（opticaldensity） 1 SN/T4417—2016 PCR：聚合酶链反应(polymerasechainreaction) SSC：柠檬酸钠缓冲液（salt-sodium citrate） ATC：酸处理的酪蛋白（acid-treatedcasein） TMB：四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine） HRP：辣根过氧化酶（horseradishPeroxidase） 4防污染措施 5方法提要 样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用大豆Lectin基因、小麦Gliadin基因、花生Arah3 量检测，根据芯片杂交信号，判断样品中是否存在常见的8种食品过敏原成分。 6可视芯片检测方法 6.1原理 将醛基标记探针固定在经过氨基化处理的芯片表面，然后使用生物素标记的引物进行PCR扩增， 扩增产物与芯片上的探针进行特定的杂交反应；接着用辣根过氧化酶抗体（HRP-antibody）处理，洗去 未杂交的DNA链，加人四甲基联苯胺（TMB）处理，生物素标记的杂交DNA链在HRP-antibody和 TMB的作用下产生沉淀而形成一层有机薄膜，这层薄膜通过改变芯片表面的厚度导致反射光的颜色 变化，从而产生肉眼可见的信号，而没有杂交成功的探针位点，无法结合抗体则无变化 6.2 仪器和设备 6.2.1 PCR仪。 6.2.2 离心机：最大离心力≥16000g。 唯信息服务平台 6.2.3 微量移液器：2.5μL、10μL、100μL.200uL、1000μL 6.2.4 冰箱：2℃~8℃，-20℃。 6.2.5 高压灭菌器。 6.2.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.2.7 精密烘箱。 6.2.8 组织研磨器。 6.2.9 漩涡震荡器。 6.2.10 pH计。 6.2.11 天平：感量0.001g。 6.3订 试剂和材料 6.3.1 CTAB提取缓冲液:20g/L，CTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/L NazEDTA用10%盐酸调pH至8.0，121℃，高压灭菌20min，备用。 6.3.2CTAB沉淀液：5g/LCTAB,40mmol/LNaCl,121℃，高压灭菌20min，备用 2