云 南 省 实 验 动 物 学 会 团 体 标 准 T/YALAS 024—2025 实验动物 内罗毕羊病毒荧光定量 PCR检测 技术 Laboratory animal-Detection ofnairobisheepvirusbyfluorescent quantitative PCR 2026-01-08发布 2026-01-15实施 云南省实验动物学会   发布CS65.020.30 CCSB44 YALAS 全国团体标准信息平台 T/YALAS 024—2025 目次 1范围................................................................................. 2 2规范性引用文件 ....................................................................... 2 3术语和定义 ........................................................................... 2 4缩略语............................................................................... 2 5试剂和引物 ........................................................................... 2 6设备和材料 ........................................................................... 2 7操作步骤 ............................................................................. 3 7.1样品的采集、存储 ............................................................... 3 7.2样本RNA的提取................................................................. 3 7.3样本RNA逆转录为 cDNA........................................................... 4 7.4试剂准备 ....................................................................... 4 7.5加样........................................................................... 4 7.6荧光定量 PCR检测............................................................... 4 7.7结果描述及判定 ................................................................. 4 附录A（资料性）溶液配制方法 ......................................................... 5 附录B（资料性）荧光定量 PCR的引物与探针 ............................................ 6 附录C（规范性） 组织和血液样本 RNA提取方法........................................... 7 附录D（规范性） RNA反转cDNA反应体系 操作方法 ........................................ 8 附录E（规范性） 荧光定量 PCR检测方法 ................................................. 9 全国团体标准信息平台 T/YALAS 024—2025 1前言 本文件按照 GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 云南省实验动物学会 提出。 本文件由 云南省实验动物学会 归口。 本文件起草单位 ：中国科学院昆明动物研究所 、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 、云南农业大学 、 南京农业大学、云南省实验动物学会。 本文件主要起草人：吕龙宝、杨鸣发、王伟、高彩霞、李昌文、赵素梅、于海波、肖文娴、张贺、 杨平、夏长友、白忠彬、谢丽分、张飞燕、李倩、孙玉林、朱俊红。 全国团体标准信息平台 T/YALAS 024—2025 2实验动物 内罗毕羊病毒荧光定量 PCR检测技术 1范围 本文件规定了实验动物内罗毕羊病毒（ NSDV）荧光定量 PCR检测技术，包括 试剂和引物、设备 和材料、操作步骤等内容。 本文件适用于 NSDV荧光定量 PCR检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室生物安全通用要求 NY/T541兽医诊断样品采集、保存 与运输技术规范 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 NSDV：内罗毕羊病毒（ Nairobi SheepDisease Virus） Ct：循环阈值（ CycleThreshold ） DEPC：焦炭酸二乙酯（ Diethyl Pyrocarbonate ） PBS：磷酸盐缓冲液（ Phosphate buffered saline） FAM：羧基荧光素（ Carboxyfluorescein ）的荧光检测通道 5试剂和引物 所有试剂均为分析纯或生化试剂， 实验室用水应符合 GB/T6682的规定；DNA/RNA 提取相关试剂 见附录 A，荧光定量 PCR检测引物探针见附录 B。 6设备和材料 6.1.1高速冷冻离心机 。 6.1.2电子天平 。 全国团体标准信息平台 T/YALAS 024—2025 36.1.3高通量核酸提取仪 。 6.1.4荧光定量 PCR仪。 6.1.5 -20℃低温冰箱和 -80℃超低温冰箱 。 6.1.6高通量研磨仪 。 6.1.7 pH计。 6.1.8高压灭菌锅 。 6.1.9生物安全柜 。 6.1.10 微量振荡器 。 6.1.11 瞬时离心机 。 6.1.12 可调移液器 （10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）和对应的无 RNA灭菌可调移液器吸 头。 6.1.13 无RNA灭菌离心管、研磨管吸附柱等。 7操作步骤 7.1样品的采集、存储 7.1.1全血样品 无菌抽取 2mL～3mL血液，放置含有 EDTA-Nas 抗凝剂的试管中 ，采血后充分混匀编号填写采样 单。全血样品的采集操作应符合 NY/T541的规定。 7.1.2组织样品 7.1.2.1 选择安乐死或者死亡 2h内的动物采集组织样品 ，组织样品的采集应符合 NY/T541的规定。 7.1.2.2 无菌采集支气管淋巴结各 3个～4个，胃黏膜、肠黏膜和肺组织各约 25g～50g，分别置于 50 mL离心管或密封袋中。 7.1.2.3 每份组织分别从三个不同位置取样，称取样品约 1g，用手术剪刀将样品剪碎混匀后取 0.1g 装入研磨管 ，于高通量研磨仪中研磨 ，加入1.5mL（0.01mo1/L pH7.4）PBS继续研磨 ，待匀浆后转 至 1.5mL灭菌离心管中， 12000g/min，离心 2min，取上清 300μL，编号备用。 7.1.2.4 组织样品的采集与处理均应符合 GB19489、NY/T541的相关要求 。 7.1.3样品存储 7.1.3.1 血清样品 血液样品采集后， 4000g/min离心10min得到血清，于 -80℃超低温冰箱保存。 7.1.3.2 组织样品 组织样品从采集到实验室处理阶段，需在 2℃～8℃保存，长期应置于-80℃冰箱保存。 7.2样本RNA的提取 组织与血液样本的 RNA提取步骤参照附录 C。 全国团体标准信息平台 T/YALAS 024—2025 47.3样本RNA逆转录为 cDNA 提取RNA核酸逆转录过程参照附录 D，也可选用其它等效逆转录试剂盒进行逆转录反应 ，制备好 的cDNA模板若暂时不进行荧光定量 PCR反应，应保存于 -80℃冰箱。 7.4试剂准备 7.4.1试验前 20min从-20℃冰箱中取出试剂盒等相应试剂，使试剂完全溶解。 7.4.2每个检测反应体系总量为 18μL：17μL的荧光 PCR反应液， 1μL的酶混合物。 7.4.3盖紧PCR反应管盖后将 荧光定量 PCR反应管转移至样本准备区 ，剩余试剂放回 -20℃冰箱冷冻 保存。 7.5加样 7.5.1分别向上述 荧光定量 PCR反应管中加入已提取样本核酸模板各 2μL，阳性对照和阴性对照核酸 模板各加 2μL，记录加样顺序。 7.5.2盖紧管盖，瞬时离心 30S，将荧光 定量PCR样本管转移至扩增区 。 7.6荧光