SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4413—2015 转基因玉米品系检测 可视芯片检测方法 Event-specific detection for genetically modified corn-Optical biosensor chip method 行业标准信息服务平台 2015-12-04发布 2016-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4413—2015 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局，北京大学。 本标准主要起草人：章桂明、向才玉、凌杏园、潘广、陈浩东、邓兴旺。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4413—2015 转基因玉米品系检测 可视芯片检测方法 1范围 本标准规定了玉米中转基因品系的可视芯片检测方法，包括检测用引物、反应体系、反应条件及结 果判定标准。 本标准适用于转基因玉米Bt176、59122、NK603、3272、GA21、MON810、MON88017、MON89034、 MIR604、MON863、MON87460、T25的品系检测。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 3原理 可视芯片技术是通过多重PCR扩增，获得生物素化PCR产物与芯片上的探针杂交，经由链霉亲和 素-碱性磷酸酶介导的显色反应在芯片表面形成色点沉积，检测结果裸眼可视， 4 设备用具及试剂 4.1 主要设备及用具 4.1.1主要设备 组织粉碎机、PCR仪、水浴锅、电子天平（精度：1/1000以上）、低温冷冻高速离心机、低温冰箱、制 冰机、恒温干燥箱、pH计、移液器（0.1uL，0.5μL.2L，10μL.20μL，100uL，200μL，1000uL）、紫外 可见分光光度计、纯水机、高压消毒锅、杂合反应仪（或使用可放置96孔板的恒温混匀器也可）、芯片点 样仪、紫外交联仪。 4.1.2主要用具 PCR 管(0. 2 mL)、离心管(1.5 mL,2. 0 mL)、Tip头(0.1 μL~10 μL,5 μL~200 uL,100 μL~500 μL)、 生物芯片。 4.2主要试剂 4.2.1常用试剂 CTAB、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、70%酒精、RNA酶（10 mg/mL）、Taq DNA聚 合酶。 1 SN/T 4413—2015 4.2.2杂合检测试剂 4.2.2.1探针缓冲液 175.3gNaCl,88.2g柠檬酸钠，溶于1000mL焦碳酸二乙酯（DEPC)水中，HCI调节pH至7.0，高 压灭菌。 4.2.2.2漂洗缓冲液 800mL超纯水中溶解0.27gKHPO.1.42gNaHPO4，8gNaCl.0.2gKCl.然后调pH至7.4， 最后定容到1L，高温高压灭菌后室温保存。使用时按体积比加入0.05%Tween-20。 4.2.2.3杂交反应液 1000mL蒸馏水溶液中包括250mL探针缓冲液，9.89%葡聚糖硫酸钠，1%BSA，0.1%SDS。 4.2.2.4洗涤液 1000mL蒸馏水溶液中包括100mL探针缓冲液，0.1%SDS。 4.2.2.5 检测液 漂洗缓冲液加1%BSA，0.1%标记有碱性磷酸酶的链霉亲和素溶液 4.2.2.6 显色液 0.1mol/LTris-HCl.0.15mol/LNaCl,1mmol/LMgCl2，调节pH至9.5。使用时新鲜配制，取 5 mL加人 33 μL NBT,16.5 μL BCIP。 4.2.3探针引物 4.2.3.1 PCR对照探针 与检测目标无关的核酸杂交片段。其杂交目标是一段人工设计合成的核酸片段或者是一段特定的 已知的目标核酸片段，在PCR反应时被掺人反应体系，参与整个检测流程。 4.2.3.2 杂交阳性对照探针 为一段5端生物素修饰核酸片段，参与杂交后的显色反应过程。 4.2.3.3 用于可视芯片方法检测的引物和探针 用于可视芯片方法检测的引物和探针见表1。所有下游引物5端用生物素修饰，探针5端加不同 长度PolyT。 表1用于可视芯片方法检测的引物和探针 核苷酸序列 检测基因 反应体系终 扩增产物片段 引物探针 或品系 (5′-3') 浓度/nmol/L 长度/bp F GACCCATATTCCAGGGCACTT 40 zein R TGTTAGGCGTCATCATCTGTGG 40 188 8T-CACCACAGCCACCACTTCTCCTTGGAC P 250 2