ICS65.020.30 CCSB40 NXSLX 宁夏饲料工业协会团体标准 T/NXSLX0606—2025 荷斯坦牛分子育种 低密度10K功能芯片设计规范 NingxiaHolsteinCattleMolecularBreeding-SpecificationforDesignof Low-Density10KFunctionalChip 2025-11-13发布 2025-12-13实施 宁夏饲料工业协会  发布 全国团体标准信息平台 T/NXSLX0606—2025 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件的发布机构对文件内容涉及的技术方法不承担商业应用的专利担保责任。 本文件由宁夏大学提出。 本文件由宁夏饲料工业协会归口。 本文件起草单位：宁夏大学、宁夏回族自治区畜牧工作站、中国农业大学、扬州大学。 本文件主要起草人：张娟、田小花、陈亮、田佳、王华、陈丝雨、姬小云、马丽琴、侯丽娥、周佳 敏、张毅、毛永江、卢徐斌。 全国团体标准信息平台 T/NXSLX0606—2025 1荷斯坦牛分子育种 低密度10K功能芯片设计规范 1范围 本标准规定了荷斯坦牛分子育种低密度10K功能芯片（以下简称“10K功能芯片”）的术语和定义、 设计流程、质量要求与检验及应用要求。 本标准适用于荷斯坦牛分子育种领域中，低密度10K功能芯片的设计、开发及相关质量控制过程； 畜禽分子育种低密度功能芯片设计可参照本标准执行。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T40184畜禽基因组选择育种技术规程 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 低密度10K功能芯片（Low-density10Kfunctionalchip） 专用于荷斯坦牛分子育种，包含约10000个关键遗传位点（以SNP为主，含少量INDEL和目标区段）， 是基于液相探针捕获技术开发的低成本、高准确性分子育种检测芯片。 SNP：指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。 INDEL：指在DNA序列中，相对于一个参考序列，发生的小片段的插入或缺失变异。 4设计流程 目标位点初步筛选 4.1.1基础数据来源 以覆盖目标群体遗传多样性的高密度芯片基因型数据为核心基础数据，数据需符GB/T40184中基因 型测定环节的DNA质量及数据完整性要求，即基因型数据完整率≥98%。 4.1.2核心SNP位点筛选 采用基于信息量与分布均匀性的算法，从基础数据中筛选出约9000个核心SNP位点，并对其重复性、 唯一性进行校验，剔除冗余位点。 4.1.3重要遗传功能位点补充 在核心SNP位点基础上，需补充收集约1000个与产奶、抗病、繁殖等关键经济性状及品种鉴别、适 应性、遗传健康等品种特异性相关的已知功能位点，共同构成约为10000个位点的初步目标位点集。 探针设计及合成 4.2.1位点核对 将初步目标位点集提交至专业机构，核对位点的基因组位置准确性及序列唯一性，剔除无效位点。 4.2.2探针设计 全国团体标准信息平台 T/NXSLX0606—2025 2基于GenoBaits液相探针捕获技术的探针设计，需满足以下三项核心质控要求： 4.2.2.1探针长度应优先选用110bp，可接受范围为100bp至120bp；探针序列的GC含量应控制在 30%～70%之间。 4.2.2.2探针应具备高度特异性，其在参考基因组中的最大相似片段数不得超过5个。 4.2.2.3探针设计必须排除基因组中的未测准或未组装区域，包括高度重复序列区及组装缺口区。 4.2.3检测面板（Panel）合成 在核对后的有效位点基础上，纳入已验证的及与目标群体遗传背景匹配的液相芯片基准位点，形成 最终的Panel，并完成探针化学合成。 探针测试及优化 4.3.1测试样本 选取一定数量具有代表性的群体样本，提取符合质量要求的基因组DNA。 4.3.2位点选择 测试应基于涵盖SNP、INDEL及目标区段的基准位点集进行探针捕获与检测，以全面评估探针性能。 4.3.3探针优化 基于大规模样本测试结果，通过多维度分层优化实现探针库性能提升，具体优化规则如下： 4.3.3.1剔除检测失败率高于设定阈值1%的探针，减少无效探针对整体检测效率的影响。 4.3.3.2针对GC含量异常的探针实施序列调整，异常判定标准为GC含量＜30%，或＞70%，通过序列 重构改善探针结合稳定性。 4.3.3.3替换与非目标区域存在高相似性的探针，相似性判定标准为相似片段个数＞5，提升探针与目 标区域的特异性结合能力。 4.3.3.4优化后需满足核心性能指标，探针组捕获效率保持稳定，其变异系数控制在5%以内。 位点集的筛选与验证 4.4.1位点集筛选 选取经优化后满足性能要求的位点形成最终位点集。 4.4.2位点检出率验证 基于足够数量的代表性样本的检测数据完成位点检出率验证，最终10K功能芯片的平均位点检出率 需≥99%，单一样本位点检出率≥98.5%，可确认位点集与探针设计合格。 5质量要求与检验 探针质量 5.1.1准确性 5.1.1.1探针与设计目标序列的一致性应≥99.9%。 5.1.1.2采用Sanger测序法，随机抽取探针总数≥1%的探针进行测序，与设计序列进行比对。 5.1.2纯度 5.1.2.1经高效液相色谱法纯化后，探针纯度应≥95%。 5.1.2.2按GB/T40184规定的高效液相色谱法进行检测。 全国团体标准信息平台 T/NXSLX0606—2025 35.1.3稳定性 5.1.3.1在-20℃±5℃条件下储存至有效期（不低于12个月）时，探针捕获效率较新合成探针的下降 幅度不应超过3%。 5.1.3.2取储存至有效期的探针与同批次新鲜探针，在相同条件下检测同一组标准样本，比较其捕获 效率。 位点质量 5.2.1特异性 5.2.1.1目标位点与非目标位点的交叉反应率应≤0.1%。 5.2.1.2采用荧光定量PCR法检测并计算目标位点与非目标位点的扩增信号比，并评估交叉反应水平。 5.2.2重复性 5.2.2.1对同一样本进行重复检测，位点检出率的变异系数应≤1%。 5.2.2.2选取至少3份样本，每份样本独立完成3次检测，计算位点检出率的变异系数。 检测性能 5.3.1位点检出率 5.3.1.1芯片平均位点检出率应≥99%，单一样本的位点检出率应≥98.5%。 5.3.1.2选取经认证合格的基因组DNA标准样本（不少于10份），按标准流程检测并计算位点检出率。 5.3.2样本适应性 5.3.2.1芯片检测应适用于目标群体全血、组织、精液等来源的基因组DNA，样本DNA浓度应在20ng/ μL~50ng/μL之间，OD260/280比值应在1.8~2.0之间。 5.3.2.2使用符合上述质量要求的不同类型DNA样本进行检测，评估其数据产出质量与位点检出率。 5.3.3检测周期 从接收合格样本至出具检测结果的总周期应不超过7个工作日。 6应用要求 试剂盒开发 10K功能芯片设计合格后，应由专业机构，依据本标准要求开发配套检测试剂盒，试剂盒需包含探 针、反应缓冲液、对照品及详细操作说明书。 应用场景 芯片及配套试剂盒应用于目标群体分子育种相关工作，需符合GB/T40184中畜禽基因组选择育种技 术要求，应用场景包括群体遗传多样性评估、关键经济性状的遗传标记辅助选择、品种纯度鉴定等。 数据管理 芯片设计过程中的位点筛选数据、探针测试数据、位点检出率验证数据等关键数据需建档保存，保 存期限3年以上；数据格式需符合相关数据标准。 全国团体标准信息平台 T/NXSLX0606—2025 4参考文献 [1]中华人民共和国农业农村部2021年发布《全国奶牛遗传改良计划（2021—2035年）》 [2]中华人民共和国农业部公告2006年第67号《畜禽标识和养殖档案管理办法》 [3]国务院办公厅国办发〔2018〕43号《国务院办公厅关于推进奶业振兴保障乳品质量安全的意见》 [4]中华人民共和国农业农村部2021年发布《新一轮全国畜禽遗传改良计划》 全国团体标准信息平台