ICS11.220 CCSB 41 NXSLX 宁 夏 饲 料 工 业 协 会 团 体 标 准 T/NXSLX 0403—2025 非洲猪瘟病毒（ASFV I 型毒株、ASFV II 型毒株混合或 ASFVI&II 型嵌合毒株）实时 荧光定量 PCR 检测技术规程 《AfricanSwineFeverVirus(ASFVTypeIStrain,ASFVTypeIIStrain Mixedor ASFVI&IIChimericStrain) Real-Time FluorescentQuantitativePCRDetection TechnicalSpecification 》 2025 -11 - 17 发布 2025 - 12 -17 实施 宁夏饲料工业协会   发 布 全国团体标准信息平台 T/NXSLX 0403 —2025 I前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心提出。 本文件由宁夏饲料工业协会归口。 本文件起草单位：宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心、青岛立见生物科技有限公司、惠农区动 物疾病预防控制中心、贺兰县农业技术推广服务中心、同心县动物疾病预防控制中心。 本文件主要起草人：马龙、李莉、艾文、葛栋、李知新、张玉玲、尹才、罗龙龙、靳善来、吴绿怡、 吴昊林、陈思思、裴元礼、任子煜、路静、王晓亮、周海宁。 全国团体标准信息平台 T/NXSLX 0403 —2025 1非洲猪瘟病毒（ASFV I 型毒株、ASFV II 型毒株混合或 ASFV I&II 型嵌合毒株）实时荧光定量 PCR 检测技术规程 1 范围 本文件规定了非洲猪瘟病毒（ASFV I型毒株、ASFV II型毒株混合或ASFV I&II型嵌合毒株）实时荧 光定量PCR检测时的实验室检测样品采集及处理、荧光定量PCR方法、结果判定、注意事项。 本文件适用于猪全血、血清、口鼻拭子、组织、环境拭子等样本中的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 18648-2020 非洲猪瘟诊断技术 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ASF:非洲猪瘟（ African Swine Fever ） ASFV:非洲猪瘟病毒（ African Swine FeverVirus ） PBS:磷酸盐缓冲液（ PhosphateBufferedBolution ） PCR:聚合酶链式反应( PolymeraseChain Reaction ) 4 生物安全措施 进行ASFV实时荧光定量PCR检测时，如样品处理、核酸提取等，应按照GB/T 19489执行。 5 实验室检测样品采集及处理 5.1 试剂 5.1.1 0.1mol/L PBS(pH7.4).配制方法见附录A的A.1。 5.1.2 0.4mol/L PBS(pH7.4).配制方法见A.2。 5.1.3 50%甘油-PBS保存液.配制方法见A.3。 5.2 采样用具 5.2.1 器械：剪刀、镊子、组织匀浆器等。 5.2.2 容器：真空采血管（含EDTA抗凝剂）、离心管（2ml、5ml、10ml）、样品保存管等。 5.2.3 个人防护用具：防护服、防护帽、防护靴、口罩、一次性手套等。 5.2.4 采样记录用品：采样单、记号笔、防水标签等。 5.2.5 其他：医用棉签、医用纱布、封口膜、冰袋等。 5.3 样品采集 全国团体标准信息平台 T/NXSLX 0403 —2025 25.3.1 全血样品采集 在发病猪群中，使用真空采血管（含EDTA抗凝剂）采集一定数量发病猪、同群猪全血各5ml，密封 后冷藏或冷冻保存。 5.3.2 血清样品采集 在每一发病猪中，采集发病猪、同群猪全血各5ml，室温放置12~24h，分离血清，装入离心管中， 密封后冷藏或冷冻保存。 5.3.3 口、鼻拭子采集 采集病死猪或发病猪、同群猪的口鼻拭子样品。用医用棉签在口腔或鼻腔转动至少3圈，采集口腔、 鼻腔的分泌物；蘸取分泌物后，立即将拭子侵入1ml 50%甘油-PBS保存液中，剪去露出部分，盖紧离心 管盖，密封后冷藏冷冻保存。 5.3.4 组织样品采集 采集病死猪或扑杀发病猪的组织样品。首选脾脏，其次为扁桃体、淋巴结、肾脏等。脾脏、肾脏采 集约3cm×3cm大小， 扁桃体整体采集， 淋巴结选取出血严重的整体采集。 将所采集样品放入50%甘油-PBS 保存液中。 5.3.5 环境拭子采集 采集病死猪或发病猪、同群猪圈内地面周边环境拭子样品。用医用棉签在圈内四周和中间方向蘸取 污染物，立即将所采集样品拭子侵入1ml 50%甘油-PBS保存液中。 5.4 样品处理 5.4.1全血样品处理 全血标记样品编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用。 5.4.2血清样品处理 血清标记样品编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用。 5.4.3口、鼻拭子处理 口、鼻拭子标记样品编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用。 5.4.4 组织样品处理 取适量采集的组织样品置于组织匀浆器中充分研磨，灭菌的0.1mol/L PBS(pH7.4)制备10%组织匀浆 液。2000r/min离心处理10min。取上清液，标记编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用。 5.4.5 环境拭子处理 环境拭子样品编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用。 6 荧光定量 PCR方法 全国团体标准信息平台 T/NXSLX 0403 —2025 36.1 试剂 6.1.1 DNA提取试剂盒。 6.1.2 无核酸酶水，配制方法见附录 B 的 B.1。 6.1.3 荧光 PCR预混液（2×）。 6.2 仪器设备 6.2.1 荧光 PCR扩增仪。 6.2.2 高速冷冻离心机（最大离心力 12000g 以上）。 6.2.3 微量可调移液器（2.5 μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格）。 6.2.4 无核酸酶离心管与吸头。 6.2.5 PCR扩增管。 6.3 引物探针 引物探针是根据已发布的毒株序列进行设计。 上游引物ASFV IF： 5'-CCCCTGAAATACACAACCTTTTTG-3'； 下游引物ASFV IR：5'-CACCTGCGTTTTATGGACACGTA-3'；TaqManASFV IT：FAM-TTCGCTTCTCGCTGA-MGB。上 游 引 物 ASFV IIF ： 5'-TAACCCCTGAAATACACAACCTTTT-3' ； 下 游 引 物 ASFV IIR ： 5'-ACCTGCGTTTTATGGACACGTA-3'；TaqManASFV IIT：VIC-TTCGATTCTCCCTGA-MGB。上游引物ASFV I&IIF： 5'-GAAGAAGAACAATGTCAGCATGATG-3'；下游引物ASFV I&IIR：5'-CGACTGTAAGGCTTAGGAAGTAATGG-3'； TaqManASFV I&IIT：Cy5-CACTTCCATACATGAACCATCTCCCAGAGA-BHQ2。 6.4 试验程序 6.4.1 核酸提取 采用DNA提取试剂盒提取各类样本中的病毒核酸，或用自动化核酸提取仪提取各类样本中的病毒核 酸。如在2h内检测可将提取的核酸置于冰上保存，否则应置于-20℃冰箱保存。 每次抽提核酸， 应至少包括一个阳性对照和一个阴性对照。 阳性对照样品应为ASFV核酸阳性样本 （全 血、血清、10%组织匀浆上清液）；阴性对照样品应为无核酸酶水。 6.4.2 核酸扩增 6.4.2.1 扩增体系 6.4.2.1.1 每个样品配制 20μL 荧光 PCR 反应混合液，组成如下： 无核酸酶水 7.22μL 荧光PCR预混液（2×） 12.50μL ASFV IF（10μmol/L） 0.10μL ASFV IR（10μmol/L） 0.10μL ASFV IT（10μmol/L） 0.08μL 6.4.2.1.2 每个样品配制 20μL 荧光 PCR 反应混合液，组成如下： 无核酸酶水 7.20μL 荧光PCR预混液（2×） 12.50μL ASFV IIF（10μmol/L） 0.10μL ASFV IIR（10μmol/L） 0.10μL ASFV IIT（10μmol/L） 0.10μL 6.4.2.1.3 每个样品配制 20μL 荧光 PCR 反应混合液，组成如下： 无核酸酶水 7.25μL 荧光PCR预混液（2×） 12.50μL ASFV I&IIF（10μmol/L） 0.10μL ASFV I&IIR（10μmol/L） 0.10μL ASFV I&IIT（10μmol/L） 0.05μL 全国团体标准信息平台 T/NXSLX 0403 —2025 4将20μL荧光PCR反应混合液加入PCR扩增管；将5μL DNA模板加入每个PCR扩增管中，每次进行荧光 PCR扩增时均应设阳性、阴性和空白对照。以标准物质、标准品或已知序列的质粒作为阳性对照模板， 阴性对照和空白对照应用无核酸酶水作为模板。加入模板后，密封PCR扩增