ICS 67.050 CCS C 146 团 体 标 准 T/ NAIA 0456—2025 红曲中桔青霉素的测定 液相色谱 -串联质谱法 Determination of Citrinin in Red Yeast by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry 2025-12- 30发布 2026-01- 10实施 宁夏化学分析测试协会 发 布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/NAIA 0456-2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》规定 起草。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。 本文件起草单位 ：宁夏回族自治区食品检测研究院（国家市场监督管理总局重点实验室（枸杞 及葡萄酒质量安全））、宁夏职业技术大学、宁夏化学分析测试协会。 本文件主要起草人 ：张瑶、龚慧、郭阳、王泽岚、刘继辉、高琳、周锦文、张赫宇、徐瑞、张 小飞。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/NAIA 0456—2025 1 红曲中桔青霉素的测定 液相色谱 -串联质谱法 1范围 本文件规定了红曲中桔青霉素的液相色谱 -串联质谱检测方法。 本文件适用于红曲中桔青霉素的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682《分析实验室用水规格和实验方法》。 GB/T 8170数值修约规则与极限数值的表示和判定》。 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4原理 试样经甲醇水溶液提取，免疫亲和柱净化，反相色谱柱分离，供液相色谱 -串联质谱仪测定， 外标法定量。 5试剂和材料 本方法所用的试剂，除另有规定外，均为分析纯，实验用 水为 GB/T 6682规定的一级水。 5.1试剂与材料 5.1.1 甲醇（ CH 3OH）：色谱纯。 5.1.2 乙腈（ C2H3N）：色谱纯。 5.1.3 甲酸（ HCOOH）。 5.1.4 70%甲醇水： 取70 mL甲醇，用水定容至 100 mL。 5.1.5 PBS缓冲溶液 ：称取 8.0 g氯化钠、 1.2 g磷酸氢二钠、 0.2 g磷酸二氢钾、 0.2 g氯化钾，用水 溶解，调节 pH至7.0，水定容至 1000 mL。 5.1.6 0.1%磷酸溶液： 准确移取 1mL磷酸加水定容至 1000 mL。 5.1.7 甲醇 -0.1%磷酸溶液（ 70+30）：取0.1%磷酸溶液 30 mL，用甲醇定容至 100 mL。 5.1.8 0.1%甲酸水溶液： 取1.0 mL甲酸，用水稀释定容至 1000 mL，混匀。 5.1.9 0.1%甲酸乙腈溶液： 取1.0 mL甲酸，用乙腈稀释定容至 1000 mL，混匀。 5.1.10免疫亲和柱： 3 mL，柱容量 20 ng。 5.1.11有机微孔滤膜， 孔径 0.22μm，或相当着。 5.2标准物质 全国团体标准信息平台 T/NAIA 0456—2025 2桔青霉素标准物质（ C13H14O5，CAS号： 518-75-2），浓度为100 μg/mL。 5.3标准溶液配制 5.3.1标准储备液 （10.0 μg/mL）：准确移取 1.0 mL桔青霉素标准物质 ，用甲醇（5.1.1）定容至 10 mL 容量瓶中，于 -18℃避光保存，保存期限为 3个月。 5.3.2标准中间液（ 1.0 μg/mL）：准确移取 1.0 mL桔青霉素标准储备液（ 5.3.1）于 10 mL容量瓶中 ， 用甲醇定容，浓度为 1.0 μg/mL，于 -18℃避光保存。 5.3.3基质标准工作液：分别移取标准中间液（ 5.3.2）0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL至10 mL容量瓶中，用阴性样品提取液定容至刻度，得到质量浓度为 1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL的标准工作液，临用现配。 6仪器和设备 6.1液相色谱 -串联质谱仪：配备电喷雾离子源。 6.2分析天平： 感量 0.01 g。 6.3涡旋混合器。 6.4高速离心机： 最大转速 9000 r/min。 6.5氮吹仪（带水浴）。 7分析步骤 7.1样品制备 取50 g红曲试样，经充分粉碎成细末，装入密闭洁净容器中标记明示，冷冻保存。 7.2样品的提取与净化 7.2.1样品提取 称取 1.0 g（精确至 0.01 g）红曲样品置于 50 mL具塞离心管中，加入 20 mL 70%甲醇水（5.1.4）， 涡旋振荡提取 5 min，8000 r/min离心 5 min，移取 1.0 mL滤液，置于另一干净的离心管中 ，加入 19 mL PBS缓冲溶液（ 5.1.5）稀释、混匀；以玻璃纤维滤纸过滤，待免疫亲和柱净化。 7.2.2样品净化 准确移取上述澄清滤液过免疫亲和柱， 以1~2滴/s的流速全部通过亲和柱 ；加入10 mL水溶液 淋洗柱子，弃去全部流出液。 准确加入 2.0 mL甲醇 -0.1%磷酸溶液（ 5.1.7）进行洗脱，收集全部洗 脱液于试管中 ，45℃氮吹至近干 ，1.0 mL甲醇溶解 ，过0.22 μm滤膜于进样小瓶中 ，供液相色谱 -串 联质谱分析。 7.3仪器参考条件 7.3.1液相色谱参考条件 a）色谱柱： Acquity BEH C18色谱柱（ 100 mm×2.1 mm，3.5 μm），或相当者； b）柱温： 30 ℃。 c）流动相： A：0.1 %甲酸水溶液 （5.1.8），B：0.1%甲酸乙腈溶液 （5.1.9），梯度洗脱条件见表 1。 d）流速： 0.3 mL/min。 e）进样量： 5 μL 全国团体标准信息平台 T/NAIA 0456—2025 3表1 梯度洗脱条件 时间 /min 流速 /（mL/min） 流动相 A/% 流动相 B/% 0.00 0.3 70 30 2.00 0.3 25 75 3.00 0.3 5 95 8.00 0.3 25 75 9.00 0.3 70 30 7.3.2质谱参考条件 a）电离方式：电喷雾离子源（ ESI）。 b）扫描方式：正离子扫描。 c）检测方式：多反应监测（ MRM）。 d）鞘气温度： 325℃。 e）鞘气流速： 10.0 L/min。 f）雾化器压力： 310.23 kPa。 g）喷嘴电压： 500 V。 h）毛细管电压： 3500 V。 i）定性离子对、定量离子对、碎裂电压、碰撞能量等参数参见 附录 A。 7.4定性测定 经确证分析 ，被测物质色谱峰保留时间与标准物质一致 ，并且在扣除背景后的样品谱图中 ，所 选择的离子均出现 ；同时，所选择离子的丰度比与标准溶液中相关离子的相对丰度一致，其在允许 偏差之内（ 见表 2），则可判定样品中存在对应的被测物。 表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >50% 20%～50% 10%～20% ≤10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 7.5定量测定 取试样溶液和相应的标准溶液 ，作校准曲线 ，以色谱峰面积定量 ，按外标法计算 ，标准溶液及 试样溶液中桔青霉素响应值均应在仪器检测的线性范围内 ，在上述液相色谱质谱条件下 ，桔青霉素 标准溶液的特征离子质量色谱图见附录 B。 7.6空白试验 除不加试样外，均按上述步骤进行。 8结果计算 全国团体标准信息平台 T/NAIA 0456—2025 4 试样中桔青霉素的含量按式（ 1）进行计算： 式中： X ──试样中化合物含量，单位为微克每千克（ μg/kg）； C ──由标准曲线计算出的试样溶液浓度，单位为 纳克每毫升（ ng/mL）； V ──试样的最后定容体积，单位为毫升（ mL）； m ──试样质量，单位为克（ g）； f ──稀释倍数； 注：测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 9精密度 在重复性测定条件下获得