广东省植物保护学会 　　发 布 中 国 标 准 出 版 社 　　出 版黑腹果蝇 S2和草地贪夜蛾 Sf9细胞系培养 美国白蛾核型多角体病毒 技术规程 Technical specifications for culturing Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus in Drosophila melanogaster S2 and Spodoptera frugiperda Sf9 cell lines 2026 ⁃01⁃14发布 2026 ⁃01⁃14实施ICS 65.100.01 CCS G 23 T/GDPPS 037—2026 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/GDPPS 037—2026 前言…………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ 引言…………………………………………………………………………………………………………… Ⅳ 1 范围………………………………………………………………………………………………………… 1 2 规范性引用文件 …………………………………………………………………………………………… 1 3 术语和定义 ………………………………………………………………………………………………… 1 4 环境与安全要求 …………………………………………………………………………………………… 2 5 物料与仪器 ………………………………………………………………………………………………… 2 6 工艺步骤 …………………………………………………………………………………………………… 3 7 质量控制指标 ……………………………………………………………………………………………… 4 8 记录与追溯 ………………………………………………………………………………………………… 5 9 废弃物处理 ………………………………………………………………………………………………… 5 附录 A（资料性） 技术指标　 ………………………………………………………………………………… 6 附录 B（规范性） 核型多角体病毒细胞生产过程批次记录表 …………………………………………… 11目 次 Ⅰ 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/GDPPS 037—2026 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由广东省植物保护学会提出并归口 。 本文件起草单位 ：广东省科学院动物研究所 。 本文件主要起草人 ：唐睿、胡文浩、赵雯、黎子上。 Ⅲ 全国团体标准信息平台 T/GDPPS 037—2026 引 言 美国白蛾核型多角体病毒 （Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus ， HcNPV ）是目前唯一对美国白蛾 具有高致病力 ，而对非靶标生物安全的病原微生物 。其制剂在农林害虫绿色防控领域极具潜力 。然而， 传统“活虫接毒 -人工收集 ”工艺存在劳动密集 、批次差异大 、易污染、无法实现封闭式自动化生产等瓶颈 ， 严重制约了 HcNPV 生物农药的规模化应用 。 近年来，昆虫细胞 -杆状病毒表达系统 （Insect Cell -Baculovirus Expression Vector System ）已在重组 蛋白和病毒载体工业化生产中获得验证 。其中，黑腹果蝇 S2细胞系和草地贪夜蛾 Sf9细胞系因生长周 期短、无CO₂依赖、血清需求低 、遗传背景清晰等优势 ，被认为是替代活体昆虫培养 HcNPV 的理想宿主 。 但天然 HcNPV 病毒粒子缺乏跨物种感染能力 ，无法直接侵染 S2/Sf9细胞。 本文件依托细胞穿膜肽 C105Y修饰脂质纳米颗粒靶向递送技术研究成果 ，首次建立了以脂质纳米 颗粒 DNAHcNPV@LNP -C105Y为媒介的体外细胞级 HcNPV 生产体系 。DNAHcNPV@LNP -C105Y的核心 是一种“杂合病毒 -脂质体纳米颗粒 ” ，用于高效递送核酸药物 ，是一种融合了合成生物学 （病毒载体改 造） 、纳米技术 （LNP）和免疫学的跨学科技术 。本系统不仅仅是针对某个特定毒株的疫苗候选 ，更是一个 具有广泛应用前景的技术范式 。该体系通过人工载体将 HcNPV 全基因组 DNA精准递送至 S2或Sf9 细胞内，实现病毒完整复制与多角体组装 ，从而摆脱对美国白蛾活虫的依赖 。与活虫饲养工艺相比 ，本文 件可将 HcNPV 的生产周期由 20 d缩短至 5 d，生产效率提升 4倍以上，并具备工艺可控 、质量均一 、自 动化潜力大等显著优势 。 为规范细胞培养 HcNPV 的过程，统一技术参数和质量指标 ，确保实验重现性与产业化放大可行性 ， 特制定本文件 。本文件能作为 HcNPV 生防微生物规模化生产 、杆状病毒杀虫剂开发及重组蛋白表达平 台构建的技术依据 ，也能为其他昆虫病毒细胞化培养提供参考 。 Ⅳ 全国团体标准信息平台 T/GDPPS 037—2026 黑腹果蝇 S2和草地贪夜蛾 Sf9细胞系培养 美国白蛾核型多角体病毒 技术规程 1 范围 本文件规定了以黑腹果蝇 S2细胞和草地贪夜蛾 Sf9细胞为宿主 ，利用细胞穿膜肽修饰脂质纳米颗 粒递送 HcNPV 病毒 DNA并实现病毒完整扩增的全部流程 、技术参数 、质控要求及记录格式 。 本文件适用于利用黑腹果蝇 S2和草地贪夜蛾 Sf9细胞系培养核型多角体病毒的实验室研究 、中试 及规模化生产 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 GB 19489　实验室　生物安全通用要求 LY/T 2906　美国白蛾核型多角体病毒杀虫剂 NY/T 3421　家蚕核型多角体病毒检测　荧光定量 PCR法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 黑腹果蝇 S2细胞系 Drosophila melanogaster S2 cell line 源自黑腹果蝇胚胎的连续传代细胞系 。 3.2 草地贪夜蛾 Sf9细胞系 Spodoptera frugiperda Sf9 cell line 源自草地贪夜蛾卵巢组织的昆虫细胞系 ，能进行贴壁或悬浮培养 。 3.3 美国白蛾核型多角体病毒 Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus ；HcNPV 专一性感染美国白蛾 ，且主要感染美国白蛾幼虫 ，导致感染后期幼虫体壁呈现液化破裂 ，并释放病毒 粒子的病原微生物 。 3.4 多肽修饰脂质 DSPE -PEG 2000-C105Y 通过化学偶联方式将具有特定生物功能的多肽分子共价连接至脂质分子上的化合物 。 注： 本文件所述多肽修饰脂质为 DSPE -PEG 2000-C105Y，是一种由 DSPE -PEG 2000-Mal与含巯基的多肽 C105Y通过 马来酰亚胺 -巯基偶联反应形成的多肽修饰脂质 ，产物中多肽与脂质间以硫醚键共价连接 。该化合物兼具脂质锚 定特性与多肽识别功能 ，可用于靶向脂质体或纳米载体的制备 。 1 全国团体标准信息平台 T/GDPPS 037—2026 3.5 多角体包涵体 polyhedral inclusion bodies ；PIB 病毒增殖的过程中 ，在寄主细胞内形成的可计数的多角体蛋白颗粒 。 3.6 脂质纳米颗粒 lipid nanoparticles 通过将可电离阳离子脂质 、磷脂、胆固醇和 PEG化脂质按特定比例混合 ，且主要功能是作为高效 、安 全的载体 ，特别是用于将核酸等物质递送到细胞内发挥作用的 ，自组装形成的纳米尺度颗粒 。 注： 本文件所述脂质纳米颗粒为 DSPE -PEG 2000-C105Y包载 HcNPV 病毒 DNA所形成的 DNAHcNPV@LNP -C105Y。 3.7 细胞穿膜肽 cell -penetrating peptides 一类能够高效穿透细胞膜并协助多种生物活性分子进入细胞内部的短肽载体 。 注： 本文件所述 C105Y为具有靶向递送功能的合成多肽 ，C105Y表示其氨基酸序列包含末端半胱氨酸残基 （Cys） ， 可提供活性巯基以与马来酰亚胺基团发生偶联反应 。 4 环境与安全要求 要求如下 ： a） 实验室级别 ：生物安全二级 （BSL -2） ，按照 GB 19489执行。 b） 操作台面每日用 75%乙醇或 0.5%次氯酸钠擦拭两次 。 c） 所有含病毒废液应经 121 ℃高压灭菌 30 min后排放。 d） S2和Sf9细胞饲养条件 ：28 ℃，无CO 2的空气气相条件 。 5 物料与仪器 5.1 试剂 5.1.1 试剂名称 HcNPV 多角体悬液 （≥1×10⁹ PIBs/mL ，-80 ℃保存） 。 5.1.2 细胞系 S2细胞、Sf9细胞，经支原体检测阴性 。 5.1.3 培养基与血清 S2：Schneider ’s Drosophila Medium（含L-谷氨酰胺 ，无酚红） 。 Sf9：TNM -FH（PM52010） 。 胎牛血清 （于56 ℃下30 min灭活） 。 青霉素 -链霉素混合液 （100×双抗） 。 5.1.4 纳米颗粒合成