ICS11.120.20 CCS C 30 团 体 标 准 T/GDMDMA 0052—2025 2025‑12‑22发布 2025‑12‑22实施 广东省医疗器械管理学会 中 国 标 准 出 版 社发 布 出 版组织提取胶原蛋白细胞划痕试验 操作规程 Operational procedures for cell scratch assay of tissue‑derived collagen 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 ⅠT/GDMDMA 0052—2025 目 次 前言…………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ 1范围………………………………………………………………………………………………………… 1 2规范性引用文件 …………………………………………………………………………………………… 1 3术语和定义 ………………………………………………………………………………………………… 1 4试验原理 …………………………………………………………………………………………………… 1 5设备、耗材与试剂 …………………………………………………………………………………………… 1 6供试液和对照组样品的制备 ……………………………………………………………………………… 2 7试验用细胞 ………………………………………………………………………………………………… 3 8试验步骤 …………………………………………………………………………………………………… 4 9结果判定 …………………………………………………………………………………………………… 5 10试验报告 …………………………………………………………………………………………………… 5 附录A（规范性）试验用细胞准备 …………………………………………………………………………… 7 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/GDMDMA 0052—2025 前 言 本文件按照 GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由广州创尔生物技术股份有限公司提出 。 本文件由广东省医疗器械管理学会归口 。 本文件起草单位 ：广州创尔生物技术股份有限公司 、瑞玞生物医学 （深圳）有限公司 、深圳市迈捷生命 科学有限公司 、广州德施普新材料科技有限公司 、广东医科大学 、广东药科大学 、广州中医药大学 、华南农 业大学生物质工程研究院 、新型生物材料与高端医疗器械广东研究院 、广东省医疗器械质量监督检验所 、 广州检验检测认证集团有限公司 、广东赤萌医疗科技有限公司 。 本文件主要起草人 ：罗思施、孟媛、达琦、张建光、张万龙、彭新生、时军、王利胜、毕桂灿、林晓娟、李婷、 南方、徐瑶、王梦杰、杨兆滢、刘泽邦、张正尧、王银港、黄立静。 Ⅲ全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 1T/GDMDMA 0052—2025 组织提取胶原蛋白细胞划痕试验 操作规程 1范围 本文件规定了动物组织提取胶原蛋白细胞划痕试验的试验原理 、试验试剂 、耗材与设备 、供试液和对 照组样品的制备 、细胞制备 、试验步骤 、结果判定与试验报告等内容 。 本文件适用于评估可溶或者部分可溶的组织提取胶原蛋白促进细胞迁移的能力 。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 YY/T1955—2025组织工程医疗器械 胶原蛋白 术语 3术语和定义 YY/T1955—2025界定的以及下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 组织提取胶原蛋白 tissue‑derived collagen 以动物组织 （如皮肤、骨骼、软骨等）为来源，运用酶解法 、酸法、盐析法等物理化学工艺进行提取 ，并 经特定处理后 ，得到的具有三螺旋结构的大分子蛋白质 。 ［来源：GB/T45992—2025，3.1，有修改］ 3.2 细胞划痕试验 cell scratch assay 一种在体外评估细胞迁移能力的试验方法 。 注：又称伤口愈合试验 （wound healing assay ） 。 4试验原理 在体外培养的单层贴壁细胞上 ，用微量枪头或其他硬物在细胞生长汇合的区域进行划线操作 ，人为 制造一个无细胞的空白区域 ，称为“划痕” 。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使 “划痕”愈合。通过测 量细胞在一定时间内 （如24h、48h）从划痕边缘向划痕中心迁移的面积 ，与初始划痕面积进行比较 ，以此 计算细胞迁移的程度 。试验通常应设定对照组和供试组 ，对照组包括阳性对照组和空白对照组 ，通过对 比不同组之间细胞迁移的程度 ，以此评价受试物促进细胞迁移的能力 。 5设备、耗材与试剂 5.1设备 二氧化碳培养箱 、移液器、生物安全柜或超净工作台 、倒置显微镜 、恒温水浴锅 、离心机、冷冻离心机 、 全国团体标准信息平台 2T/GDMDMA 0052—2025 冰箱、超低温冰箱 、钢尺。 5.2耗材 细胞培养瓶 、24孔细胞培养板 （贴壁型） 、移液器枪头 、冻存管、离心管、试剂瓶、0.22μm无菌滤膜 、精 密pH试纸。 5.3试剂 冰醋酸（分析纯） 、氢氧化钠 （分析纯） 、胎牛血清 、纯化水、DMEM培养基（无谷氨酰胺 、无钙离子 、葡 萄糖含量 4.5g/L）、胰蛋白酶 -EDTA（0.25%）、磷酸盐缓冲液 （PBS）、L-谷氨酰胺溶液 （200mmol/L ， 100×） 、重组人表皮生长因子 （animal‑free recombinant human epidermal growth factor ，EGF） 、钙离子吸附 树脂Chelex100Resin、0.1%牛血清白蛋白 （bovine serum albumin ，BSA，细胞培养用 ） 、青霉素 -链霉素混 合溶液（100×） 。 5.4试剂配制 5.4.10.1mol/L的醋酸溶液 ：准确量取 5.72mL冰醋酸，用纯化水定容至 1000mL。 5.4.24mol/L的氢氧化钠溶液 ：称取4.00g氢氧化钠 ，加入纯化水溶解并定容至 25mL。用0.22μm 滤膜过滤 ，制备成4mol/L氢氧化钠溶液储备液 ，室温保存 。 5.4.3去钙离子血清 ：称取1.50g钙离子吸附树脂 Chelex100Resin至50mL离心管，加入30mL胎牛 血清，在2℃~8℃条件下温和且充分混合 2h，离心或者静置去除树脂 ，取上清液于无菌环境下用 0.22μm 滤膜过滤 ，即得到去钙离子血清 。 可将离心管水平固定于翘板摇床或采用其他替代方式 ，确保钙离子吸附树脂 Chelex100Resin始终 均匀分散于胎牛血清中 ，无局部沉淀或分层 。混合过程中避免剧烈搅拌或高速振荡 ，防止胎牛血清中活 性成分破坏 。 5.4.4基础培养基 ：按照99∶1的体积比将 DMEM培养基（无谷氨酰胺 、无钙离子 、葡萄糖含量 4.5g/L） 与L-谷氨酰胺溶液 （200mmol/L ，100×）混合。 5.4.5完全培养基 ：按照9∶1的体积比将基础培养基与去钙离子血清混合 。 5.4.6EGF母液（0.1mg/mL） ：开瓶前4℃，4000r/min离心5min，加入适量恢复至常温的 0.1%BSA （细胞培养用 ）溶液，使终质量浓度为 0.1mg/mL。轻轻混匀溶解 EGF粉末。待EGF粉末充分溶解后短 暂离心分装并于超低温冰箱保存 。 5.4.7EGF储存液（10μg/mL） ：将EGF母液（0.1mg/mL）用0.1% BSA（细胞培养用 ）溶液进行 10倍 稀释，轻轻吹打混匀 ，分装并放置于 -80℃超低温冰箱中保存 。 6供试液和对照组样品的制备 6.1通用要求 供试液制备过程中应避免加热 （样品温度不应超过其热变性温度 ）或冷冻，同时应避免激烈的振荡 、 搅拌或超声处理 ，因为加热或剪切力等因素会导致供试液中的胶原蛋白变性 ，从而影响测试结果的准 确性。 供试液一般宜在测试的当天配制 ，必要时可提前 1d配制并在 2℃~8℃冰箱储存 。 供试液配制过程保持无菌操作 。 全国团体标准信息平台