T/GDAAV 0212—2025 ICS 65.020 CCS A 03.21 团体标 准 鸡球虫卵囊基因组 DNA提取方法 Isolation of Genomic DNA From Chicken Coccidia Oocysts 2025-12-26发布 2026-01-01实施 广东省畜牧兽医学会 发 布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/GDAA V 0212—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 广东省农业科学院动物卫生研究所、 广东省畜牧兽医学会提出 。 本文件由广东省畜牧兽医学会 归口。 本文件起草单位： 广东省农业科学院动物卫生研究所、中农华威制药股份有限公司 。 本文件主要起草人： 蔡海明、孙铭飞、游锡火、廖申权、戚南山、李 娟、林栩慧、吕敏娜、宋勇 乐、陈祥杰、朱易斌、张健騑、何钦义、曾徐浩 。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/GD AAV 0212 ―2025 1 鸡球虫卵囊基因组 DNA提取方法 1 范围 本文件规定了鸡球虫卵囊基因组 DNA提取方法 的技术要求。 本文件适用于实验室条件下对鸡球虫 病病原进行分子生物学鉴定及相关基因组分析。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本 适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 4629 检疫性有害生物凭证标本核酸制备、保存与管理规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适合本文件。 PBS：磷酸盐缓冲生理盐水（ Phosphate buffered saline ） TE：TE缓冲液（ TE buffer ），由Tris（最常用的 pH 缓冲试剂）和 EDTA（二价金属离子螯合剂）两 种试剂组成 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（ Cetyltrimethylammonium bromide ） Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（ Tris (hydroxymethyl) aminoethane ） EDTA：乙二胺四乙酸（ Ethylenediaminetetraacetic acid ） NaCl：氯化钠（ Sodium chloride ） NaAc：乙酸钠（ Sodium acetate ） OD：光密度（ Optical density ） 5 操作程序 5.1 样品前处理与纯化 5.1.1 粪便样品前处理与纯化 采集新鲜鸡粪样品， 置于烧杯中， 加入5倍～10倍体积的 三级水 （符合 GB/T 6682 规定）或生理盐水， 充分振荡混匀。使用 2层～4层纱布或标准筛（ 80目或100目）过滤，去除粪渣和粗颗粒。收集滤液， 1 500 g离心10 min，弃上清。用饱和 氯化钠溶液重悬沉淀，充分混匀后，以 800 g～1 000 g离心10 min。卵 全国团体标准信息平台 T/GDAAV 0212—2025 2 囊会漂浮于液面。 取上层液体， 加入10倍～15倍体积水，混匀后 1 500 g离心10 min，弃上清。重复水 洗涤步骤 3次～5次，以充分去除饱和 氯化钠溶液，收集处理后的卵囊沉淀备用。 5.1.2 卵囊样品前处理 取约1×103个纯化后或保存 于2.5%重铬酸钾溶液的鸡球虫孢子化卵囊， 置于 1.5 mL离心管中， 12 000 g离心5 min，弃上清；沉淀以 1 mL PBS缓冲液洗涤 3次，12 000 g离心5 min，弃上清；沉淀以 200 µL 20%次氯酸钠溶液重悬，混匀，冰浴条件下放置 30 min；沉淀以 1 mL无菌去离子水 洗涤3次，12 000 g离 心5 min，弃上清，收集处理后的卵囊备用。 5.2 样品的裂解 5.2.1 玻璃珠处理法 取5.1处理后收集的卵囊沉淀 ，以200 µL TE缓冲液（ pH 8.0）重悬；加入 200 mg直径0.8 mm～1 mm 无菌玻璃珠，以 涡旋振荡器 最大转数，振荡 5 min～10 min，显微镜下观察孢子囊和子孢子释放情况， 确认卵囊壁破碎率 ≥95%后，取上清液；加入 600 µL CTAB溶液（pH 8.0）、1/40体积的蛋白酶 K溶液， 65℃水浴作用 1 h，备用。 5.2.2 裂解液处理法 取5.1处理后收集的 卵囊沉淀 ，以10 µL次氯酸钠溶液， 4℃孵育1.5 h；加入35 µL饱和氯化钠溶液， 55℃孵育1 h，3 100 g离心10 min，取上清液，备用。 5.3 卵囊基因组 DNA的提取 5.3.1 酚-氯仿法 本方法为经典的基因组 DNA提取方法，适用于获取高纯度、高分子量的 DNA，可用于 PCR、基因组测 序及文库构建等后续实验。 取5.2.1处理后的CTAB裂解原液 ，加入400 µL无菌去离子水 ，12 000 g离心5 min，取上清液；加入 等体积苯酚，上下颠倒混匀， 12 000 g离心5 min，取上清 液；加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇溶液（ 25 ﹕24﹕1），上下颠倒混匀， 12 000 g离心5 min，取上清 液；加入等体积氯仿：异戊醇溶液（ 24﹕1）， 上下颠倒混匀， 12 000 g离心5 min；将上清转移至新的 1.5 mL离心管中，加入 1/10体积的3 M NaAc（pH 5.2）、2倍体积预冷无水乙醇，混匀， -20℃放置20 min～30 min，12 000 g离心10 min，弃上清；以 70%乙醇洗涤 DNA沉淀，重复洗涤过程，弃上清；室温干燥后，加入 50 µL无菌去离子水 或TE缓冲液（pH 8.0）溶解DNA，备用。 5.3.2 DNA提取试剂盒 法 本方法适用于快速、 批量提取基因组 DNA， 操作简便， 提取的 DNA适用于PCR及常规分子生物学检测。 取5.2裂解后的溶液 ，按动物组织或粪便样品基因组 DNA提取试剂盒 使用说明 进行基因组 DNA的提取、纯 化。 5.3.3 热处理法 本方法为快速简易 提取方法，DNA产物纯度较低，但可满足常规 PCR检测的需求。 取5.1处理后收集的全部 卵囊沉淀 ，以200 µL TE缓冲液（ pH 8.0）重悬；加入 200 mg直径0.8 mm～ 1 mm无菌玻璃珠，以 涡旋振荡器 最大转数，振荡 5 min～10 min，显微镜下观察孢子囊和子孢子释放情 全国团体标准信息平台 T/GD AAV 0212 ―2025 3 况，大部分卵囊壁破碎后，取上清液；裂解后的溶液转移至新的离心管， 99℃孵育5 min，5 200 g离心 5 min，取上清液，备用。 5.4 基因组 DNA提取质量的检测 5.4.1 基因组 DNA浓度检测 以紫外分光光度法检测 DNA浓度。以溶解 DNA的溶液为参比，测定 DNA样品在260 nm的吸光值。当 OD260 值为1.0时，相当于 50 μg/mL的双链DNA，要求提取基因组 DNA浓度大于 20 ng/μL。若未达到要求的浓 度，可浓缩 DNA样品；若 OD260值>1.0时，需对高浓度 DNA样品进行稀释。 5.4.2 基因组 DNA纯度评价 以紫外分光光度法检测 DNA纯度。以溶解 DNA的溶液为参比，分别测定 DNA样品在260 nm、280 nm、 230 nm的吸光值， 计算 OD260/OD280、OD260/OD230的值。 同时满足 OD260/OD280为1.8～2.0，OD260/OD230为2.0～2.2， DNA样品纯度良好。 5.5 基因组 DNA的保存 DNA样品测定核酸浓度后， 短期保存可置于 4℃冰箱， 时间不宜超过 14 d； 长期保存置于 -20℃冰箱， 按照SN/T 4629 的要求进行操作。 全国团体标准信息平台 T/GDAAV 0212—2025 4 A A 附 录 A （规范性） 试剂及其配制 A.1 2.5%重铬酸钾溶液 A.1.1 成分 重铬酸钾（ K₂Cr₂O₇） 25 g A.1.2 制法 取A.1.1中各成分，溶解于适量符合 GB/T 6682 规定的三级水中， 用三级水 定容至1 000 mL，充分溶 解后避光保存。 A.2 PBS缓冲液（ pH 7.4） A.2.1 成分 磷酸二氢钾（ KH₂PO₄） 0.27 g 磷酸氢二钠（ Na₂HPO₄·12H₂O） 1.42 g 氯化钠（ NaCl） 8.0 g 氯化钾（ KCl） 0.2 g A.2.2 制法 取A.2.1中各成分 ，溶解约800 mL符合GB/T 6682 规定的三级水中，调节 pH至7.4，用三级水定容至 1000 mL，充分溶解后， 121℃高压灭菌 15 min。 A.3 20%次氯酸钠溶液