团 体 标 准 食源性污染物对卵巢健康 影响 黑腹果蝇模型快速 筛查法 Impact of Foodborne Contaminants on Ovarian Health: A Rapid Screening Method Using the Drosophila melanogaster Model 安徽省食品科学技术学会 发布T/AHFS 002-2026 ICS 67.050 CCS C 53 2026-01-05发布 2026-01-16实施 全国团体标准信息平台 T/AHFS 002-2026 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定起 草。 本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由 安徽医科大学 提出。 本文件由 安徽省食品科学技术学会 归口管理。 本文件起草单位： 安徽医科大学、安徽医科大学第二附属医院。 本文件主要起草人： 韦田、王华、刘宗忠、蔡杨、宋玉荣、吴磊、朱家佐、杨俊林、赵玲俐、徐德 祥。 本文件为首次制定。 全国团体标准信息平台 T/AHFS 002-2026 2 食源性污染物对卵巢健康影响 黑腹果蝇模型快速筛查法 1 范围 本文件规定了采用黑腹果蝇（ Drosophila melanogaster ）作为生物模型快速评估食源 性污染物对卵巢健康影响的原理、试剂与溶液、仪器与设备、试验方法、数据处理与结果判 定、质量控制、试验报告及生物安全与伦理。 本技术规范适用于食源性污染物卵巢毒性快速初筛，不作为判定其安全性的唯一依据。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本 适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件， 其最新版本 （包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 35823 实验动物 动物实验通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 卵巢毒性 ovotoxicity 由外源化学物引起的卵巢结构和功能损害，可表现为卵巢萎缩或畸形、生殖干细胞数量 显著减少、产卵数下降、卵子孵化率降低等。 3.2 生殖干细胞 germline stem cell 位于雌性果蝇卵巢管顶端原卵区（ germarium ）微环境内的一类成体干细胞。它通过不 对称分裂进行自我更新，并产生分化的子代细胞，从而持续维持卵子发生过程，通常每个原 卵区有2~3个生殖干细胞。 4 原理 黑腹果蝇作为经典的模式生物，其卵巢发育、卵子发生及生殖调控的核心信号通路（如 Notch、Hippo、JAK/STAT 等）与哺乳动物高度保守。食源性污染物通过饮食途径暴露于果 蝇，进而影响其卵巢健康。通过检测污染物暴露后果蝇的卵巢形态结构、产卵数、卵子孵化 率、 生殖干细胞数等终点指标， 可以快速、 有效地评估该污染物对卵巢健康的潜在毒性作用。 全国团体标准信息平台 T/AHFS 002-2026 3 5 试剂与溶液 5.1 标准培养基 实验所用标准培养基的配方为：玉米粉 25 g，大豆粉 2.5 g，白糖 3.625 g，红糖 10 g，酵母粉 6.25 g，琼脂 2.5 g，蒸馏水加至 500 mL。配制时，将上述成分加热煮沸溶解， 室温冷却至 70 ± 2 ℃后，加入 10 mL防腐剂溶液（配方：对羟基苯甲酸甲酯 40 g、无水 乙醇400 mL、丙酸100 mL），搅拌均匀后分装。 5.2 受试物 根据受试物性质，选用超纯水、二甲亚砜（ DMSO，CAS#67-68-5，终浓度 < 0.1 %）、 乙醇（CAS#64-17-5）等溶剂配制，应记录所用溶剂及浓度。 5.3 对照物 试验应设置阴性对照组和阳性对照组。阳性对照可选择氯丙醇（如 3-氯-1,2-丙醇， CAS#96-24-2）；重金属镉（如氯化镉， CAS#10108 -64-2）。阳性对照物质浓度应能稳定产 生卵巢毒性效应。 5.4 解剖与固定液 磷酸缓冲盐溶液（ 1 × PBS，CAS#12111 -21-6， pH 7.4）、0.3% PBST （1×PBS溶液 中加入0.3% Triton -100，v/v）（Triton-100，CAS#9036 -19-5）、4%多聚甲醛磷酸缓冲液 （PFA，CAS#30525 -89-4）、5% 山羊血清（ 0.3% PBST 中加入5%的山羊血清原液）、免疫 组化一抗稀释液 、50%甘油、指甲油。 5.5 染料与抗体 用于细胞核标记荧光染料 DAPI (4',6 -diamidino -2-phenylindole,4,6 -二脒基-2-苯基 吲哚)；一抗Hts (Hu-li tai shao ，生殖干细胞标记物）；二抗 -羊抗小鼠 （FITC或CY3）。 6 主要仪器与设备 恒温恒湿培养箱、体视显微镜、果蝇饲养管、精密分析天平、超纯水系统、 4 ℃冰箱、 -20 ℃冰箱、 -80 ℃超低温冰箱、倒置荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜。 7 试验方法 7.1 实验动物 黑腹果蝇（ Drosophila melanogaster ），宜使用野生型品系。所用品系应来源清晰， 遗传背景明确，并在标准条件下维持足够代数以保持遗传稳定性。 全国团体标准信息平台 T/AHFS 002-2026 4 7.2 果蝇饲养环境 果蝇饲养条件：温度 25 ± 1 ℃、相对湿度 60 ± 5 %、光周期 12 h 光照/12 h 黑暗 循环。收集 8 h 内新羽化的成虫，用 CO₂短暂麻醉后进行雌雄分离。将雌性果蝇随机分入各 组，确保每组初始体重和数量一致（推荐每组 ≥ 30只，每组至少设置 3个平行重复）。 分组过程应快速完成，以减少应激。 7.3 实验设计 7.3.1实验动物分组 将三日龄雌性果蝇随机分为以下组别，每组至少设置 3个平行重复，每个平行不少于 30只果蝇： a）空白对照组：饲喂不含任何添加剂的标准培养基（配方见 5.1）。 b）溶剂对照组：若受试物需使用溶剂（如 DMSO）助溶，此组饲喂含有与受试物组最高 溶剂浓度相同（例如 < 0.1% DMSO ）的标准培养基，以排除溶剂本身可能产生的影响。 c）受试物组：饲喂含有不同浓度受试物的标准培养基。通常设置低、中、高 3个浓度 梯度。建议以食品中的真实环境暴露浓度作为中剂量，并以此为基础上下调整（如缩小和放 大10倍）设置低剂量和高剂量。具体浓度需通过预实验进行验证与优化，以确保能有效观 察到剂量 -反应关系。 d）阳性对照组：饲喂混有已知卵巢毒性食源性污染物的标准培养基。 7.3.2饲养管理 将分组后的果蝇在标准环境下饲养，每 2 d 更换一次新鲜配制的相应培养基，以防止 培养基变质及成分变化，并记录果蝇的存活情况。饲养周期为 7 d~14 d（依据预实验确定 具体终点时间），饲养结束后用于本文件 7.4的各项指标检测。 7.4 观察指标 7.4.1 产卵能力测定 将受试物暴露结束后的雌性果蝇与正常雄性果蝇按 1:1比例配对交配。交配 24 h后， 分离雌蝇，将每只雌蝇单独转移至含有标准食物培养基的培养瓶中。此后每 24 h更换一次 新鲜培养基，并在体视显微镜下对培养基表面的卵进行计数，连续记录 7 d。最终计算每只 雌蝇的日均产卵数（日均产卵数 = 7 d 内总产卵数 / 7 d / 雌蝇数量）。 7.4.2 卵子孵化率统计 完成产卵计数后，将含有受精卵的培养皿在标准环境条件下继续培养 24 h ~48 h。随 后，在体视显微镜下观察并统计成功孵化的一龄幼虫（ L1幼虫）数量。卵子孵化率按以下 公式计算：卵子孵化率（ %） = （成功孵化的 L1幼虫数量 /观察的受精卵总数）× 100%。 7.4.3 卵巢形态观察与统计 受试物暴露结束后的雌蝇，在体视显微镜下，用解剖镊 取出完整的卵巢组织，置于预冷 的1×PBS中。观察卵巢的整体形态，重点关注卵巢管是否出现松散、断裂或其他异常结构 变化。使用图像采集系统获取卵巢图像，并利用统计分析软件测量卵巢面积。 全国团体标准信息平台 T/AHFS 002-2026 5 7.4.4 生殖干细胞数目统计 采用免疫荧光染色法标记并统计卵巢生殖干细胞数目，具体步骤如下： a）受试物暴露结束后的雌蝇，解剖取出完整卵巢，迅速置于 4%多聚甲醛溶液中，室温 固定10 min； b）随后用 0.3% PBST 快速冲洗 2 次，再加入 0.3% PBST 置于摇床上清洗 6 次，每次 10 min； c）吸弃液体，加入 5%山羊血清，室温封闭卵巢组织至少 2 h。吸弃 5% 山羊血清，加 入用免疫组化一抗稀释液稀释的 Hts 抗体（稀释比例 1:20），4 ℃冰箱中过夜孵育； d）回收一抗，重复步骤 b）后加入用 5%山羊血清稀释的羊抗小鼠 FITC/CY3 标记的荧 光二抗（稀释比例 1:500），4 ℃冰箱中过夜孵育或室温避光孵育至少 2 h； e）回收二抗，重复步骤 b）后加入细胞核 DAPI 染液，室温避光染色 8 min； f）回收 DAPI 染液，重复步骤 b）； g）将组织放到加有 50%