ICS 85.140 B 47 备案号： GH 中华人民共和国供销合作行业标准 GH/T 1081—2012 蜂胶中杨树胶的检测方法 反相高效液相色谱法 The determination of poplar tree gum in propolis Reversed-phase High Performance Liquid Chromatography Method 2012 - 07 - 09 发布 2012-08-01实施 中华全国供销合作总社 发布 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 前言 本标准遵循GB/T1.1一2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的编写规则。 本标准采用专利201010180675.0（申请号）。 本标准的附录A为规范性附录，附录B和附录C为资料性附录。 本标准由浙江大学提出。 本标准由中华全国供销合作总社归口。 本标准起草单位：浙江大学、中国蜂产品协会。 本标准主要起草人：胡福良、张翠平、郑火青、吕泽田。 PDF created with pdfFactory Pro trial versionwww.pdffactory.com 引 言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，涉及到本文件相关的专利申请（申请号： 201010180675.0）的使用。 本文件的发布机构对于该专利申请的真实性、有效性和范围无任何立场 该专利申请人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就相关授权许可进行谈判。该专利申请人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联 系方式获得： 专利申请人：浙江大学 地址：浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号。 请注意除上述专利申请外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些 专利的责任。 PDFcreated with pdfFactory Pro trial versionwww.pdffactory.com 蜂胶中杨树胶的检测方法 反相高效液相色谱法 1范围 本标准规定了蜂胶中是否含有杨树胶的反相高效液相色谱检测方法。 本标准适用于蜂胶原料及蜂胶乙醇提取物中杨树胶的检测。 本标准在进样量为5uL时，水杨苷的最低检测限为1.3μg/mL，蜂胶原料中杨树胶的检出下限约为 5%，蜂胶乙醇提取物中杨树胶的检出下限约为15%。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 24283-2009 蜂胶 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 蜂胶propolis 工蜂采集树脂等植物分泌物与其上颚腺、蜡腺分泌物等混合形成的胶粘性物质。 3. 2 蜂胶乙醇提取物ethanolextractedpropolis 乙醇萃取蜂胶后得到的物质。 3. 3 杨树胶extractedpopulusbuds,leavesorbarks 杨属（Populus）植物的芽、叶子或树皮等组织经人工熬制加工，再经乙醇提取而成的提取物。 PDF created with pdfFactory Pro trial versionwww.pdffactory.com 3. 4 杨树型蜂胶 poplartypepropolis 杨属（Populus）为主要植物来源的蜂胶。 3. 5 杨树胶特征性成分acharacteristiccomponentsofpoplartreegum (CCP) 杨树胶中含有而蜂胶中不含有的分子量为406的特征性成分， 3. 6 水杨苷salicin 水杨酸盐类酚苷的基本结构单元，广泛存在于杨属和柳属植物的芽、叶子和树皮中的主要降解产 物之一。 4原理 水杨苷广泛存在于杨属和柳属植物的芽、叶子和树皮中，西方蜜蜂（Apismellifera）在采集杨属植 物树脂以及蜂巢内传递这些树脂加工成蜂胶的过程中加入了其腺体分泌的β-葡萄糖苷酶等，将树脂中 所含有的水杨苷水解。但是，在杨树胶加工过程中水杨苷能稳定存在。因而水杨苷是区分蜂胶与杨树胶 的有效指标。在本标准检测条件下，除了水杨苷外，还发现另一个特征性更强的杨树胶中含有而蜂胶中 不含有的特征峰，其指示为CCP。因此，可根据水杨苷或CCP的有无来定性确定蜂胶中是否含有杨树 胶。 试样经乙醇提取后，经浓缩、溶解于水后，用配有紫外检测器的反相高效液相色谱仪在213nm处 检测水杨苷和CCP的有无，从而判断蜂胶中是否含有杨树胶。 C 试剂和材料 除非另有规定，所有试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682-2008中一级水的规定要求。 5.1甲醇：色谱纯。 5.2乙腈：色谱纯。 5.3乙醇：分析纯。 5.4磷酸：分析纯。 5.5水杨苷标准品：纯度≥98%。 5.60.5%磷酸（5.4）溶液：量取5mL磷酸，用高纯水定容至1L。 5.7标准贮备液：准确称取水杨苷标准品（5.5）10mg，用甲醇溶液（5.1）配制成1.0mg/mL的标准 溶液，于4℃冰箱保存。 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 5.8标准工作液：吸取适量1.0mg/mL的标准贮备液（5.7），用甲醇溶液（5.1）分别稀释成0.005mg/mL、 0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL和0.06mg/mL五个浓度，现用现配。 5.9滤膜：0.45μm。 6 仪器和设备 6.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器。 6.2粉碎机。 6.3旋转蒸发仪。 6.4超声波清洗器。 样品的取样及预处理 从被检样品的不同部位均匀取样50g，冷冻，粉碎，混匀，作为备检样品。 8 3试验方法 8.1供试样品溶液的制备 称取1g蜂胶乙醇提取物试样或2g蜂胶原料试样，用75%乙醇超声波提取30min，料液比为1：15 (W/V)，反复提取3次。合并滤液，离心过滤后旋转蒸发除去乙醇，然后用蒸馏水定容至50mL，取上清 液，0.45um滤膜过滤，供液相色谱测定。 8.2色谱条件 色谱柱：SepaxHP-C18，柱长150mm，内径4.6mm，粒度5μm；或性能相当的色谱柱。 流动相流速：1mL/min。 梯度洗脱，洗脱程序见附录A表A.1。 检测波长：213nm。 柱温：30℃。 进样量：5μL。 8.3测定 取5μL样品溶液（8.1）和水杨苷标准工作液（5.8）（控制标准液浓度与试样溶液中水杨苷的浓 度尽量接近）分别进样分析，根据水杨苷的含量和CCP的有无确定是否存在杨树胶。 水杨苷标准品、杨树型蜂胶、杨树胶、掺5%杨树胶的蜂胶原料及掺15%杨树胶的蜂胶乙醇提取物 的色谱图参见附录B。 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 8.4结果计算 试样中水杨苷含量（X）以毫克每克（mg/g）表示，按式（1）计算： X = CsxVxA mxAs (1) 式中： Cs一水杨苷标准溶液的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； V一试样最终定容体积，单位为毫升（mL）； As一水杨苷标准溶液对应的峰高或峰面积； A一试样溶液对应的峰高或峰面积； m一样品质量，单位为克（g）。 将符合重复性要求的两个独立测定值的算术平均值作为测定结果（mg/g），保留两位有效数字。平 行试验相对偏差不得超过2.0%。 8.5结果判定 本方法所检测水杨苷和CCP为杨树胶中含有而蜂胶中不含有的物质。如果待测样品中检测不到水 杨苷或待测蜂胶乙醇提取物样品中水杨苷检测浓度小于0.25mg/g，或待测蜂胶原料样品中水杨苷检测 浓度小于0.15mg/g，并且检测不到CCP，则该样品为未检出杨树胶的样品；如果待测蜂胶乙醇提取物 样品中水杨苷检测浓度大于0.25mg/g，或待测蜂胶原料样品中水杨苷检测浓度大于0.15mg/g，无论检 测到CCP与否，该样品判定为检出杨树胶的样品；如果待测样品中检测不到水杨苷，而检测到CCP的， 则采用质谱法作进一步验证（质谱检测条件参见附录C）。确定为CCP的，则该样品判定为检出杨树 胶的样品。 PDF created with pdfFactory Pro trial versionwww.pdffactory.com