SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4283.5—2015 国境口岸微孔板基因芯片检测方法 第5部分：肺炎支原体、肺炎衣原体及 嗜肺军团菌 Test method of microplate gene chip at frontier port-Part 5 : Mycoplasma pneumonia,chlamydia pneumonia and legionella pneumophila 行业标准信息服务平台 2015-05-26发布 2016-01-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4283.5—2015 前 言 SN/T4283《国境口岸微孔板基因芯片检测方法》为系列标准，分为六个部分： 第1部分：通用技术规程； 第2部分：结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因； 第3部分：7种呼吸道病毒； 一第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型； 第5部分：肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌； 第6部分：12种食源性致病菌。 本部分为SN/T4283的第5部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民 共和国四川出人境检验检疫局、中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、珠海精标仪器有限公司， 本部分主要起草人：何建安、樊学军、徐媛、高国龙、廖凌、赵纯中、史蕾、刘春晓、赵芳、徐云庆、 李永进。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4283.5—2015 国境口岸微孔板基因芯片检测方法 第5部分：肺炎支原体、肺炎衣原体及 嗜肺军团菌 1范围 SN/T4283的本部分规定了国境口岸3种非典型肺炎病原体（肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军 团菌）的微孔板基因芯片检测方法， 本部分适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术对3种非典型肺炎病原体（肺炎支原体、 肺炎衣原体及嗜肺军团菌）检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T2351出人境口岸军团菌检验规程 SN/T2752.4一2011卫生检疫人员的自我防护规范第4部分：实验室人员 SN/T2770国境口岸军团菌荧光PCR检测方法 SN/T4283.1国境口岸微孔板芯片检测方法第1部分：通用技术规程 WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 3术语和定义 SN/T4283.1界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 非典型肺炎 atypicalpneumonia 是相对于典型肺炎而言的，多由支原体、衣原体、军团菌、立克次体、病毒及其他一些不明微生物等 病原引起，症状、肺部体征、验血结果没有典型肺炎感染明显，一些病毒性肺炎抗菌素无效。 3.2 肺炎支原体 mycoplasmapneumonia 引起非典型性肺炎的常见病原体，大小约为0.2um～0.3μm，呈现高度的多形态性，没有细胞壁， 胞质内含有环状双链DNA游离于胞质内，是基因组最小的原核细胞。 3.3 肺炎衣原体 chlamydiapneumonia 主要引起非典型性肺炎，原体形态多样，核区呈圆形，位于细胞中央，核区和细胞膜之间有较宽的原 生质区。肺炎衣原体不能体外培养，只能在细胞内寄生，鸡胚对其不敏感，因此一般用细胞培养传代， 由于肺炎衣原体感染没有典型的临床表现，其诊断主要依靠实验室检测 1 SN/T 4283.5—2015 3.4 曙肺军团菌legionellapneumophila 又名退伍军人杆菌，属军团菌科军团菌属，为有鞭毛的革兰氏阴性杆菌，兼性需氧，无芽孢，无荚膜。 主要存在于温暖潮湿的自然环境，也广泛分布于人工供水系统中，是一种原发的人类病原体，可引发军 团病。 4缩略语 SN/T4283.1界定的以及下列缩略语适用于本文件。 MP：肺炎支原体（mycoplasmapneumonia） CP：肺炎衣原体（chlamydiapneumonia） LP：嗜肺军团菌（legionella pneumophila) 5生物安全防护要求 5.1实验室应遵循GB19489和WS233对应的生物安全要求。 5.2实验人员的防护遵循SN/T2752.4一2011的要求。 6主要设备和试剂 6.1主要设备：基因芯片点样仪、芯片杂交仪、芯片清洗显色仪、生物芯片全自动扫描判读仪、PCR仪、 生物安全柜、离心机、移液器、恒温水浴锅等。 6.2主要试剂：非典型肺炎病原体（肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌）的微孔板基因芯片检测试 剂盒或自行设置的非典型肺炎病原体（肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌）的微孔板基因芯片检测 试剂（相关引物及探针序列参见附录A）。 7检测流程 7.1 样品核酸的提取 按照SN/T2351和SN/T2770处理样品，提取基因组DNA 7.2PCR扩增反应 10×PCR缓冲液2.5μL，dNTPs（各5μmol/L)2μL，MgCl2（25mmol/L）2μL，所有上下游引物（含 PCR阳性对照）（各5μmol/L）混合液2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，模板核酸5μL（含阳性对照核 酸1μL,主要为细菌基因组DNA),ddH,O11.25μL;振荡混匀，并轻微离心。 7.2.2将上述PCR反应管放入PCR仪，设定PCR反应程序：首先95℃变性5min;然后95℃变性20s， 50℃退火20s，72℃延伸40s，10个循环；然后95℃变性20s，53℃退火20s，72℃延伸40s，25个循 环；最后72℃延伸10min，4℃保存备用；若需长期使用请置于一20℃保存。 7.3微孔板基因芯片杂交反应 7.3.1开启芯片杂交仪，并设置芯片杂交仪预加热至45℃。 7.3.2按试验要求准备所需的微孔板基因芯片，并准确、清晰标记。将杂交反应液平衡至室温，轻轻摇 2