SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2245—2009 化学品 体外皮肤腐蚀 人体皮肤模型试验 ChemicalsIn vitro skin corrosion-Human skinmodel test 2009-09-01实施 2009-02-20发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 化学品体外皮肤腐蚀 人体皮肤模型试验 SN/T2245—2009 * 中国标准出版社出版 北京复兴门外三里河北街16号 邮政编码：100045 网址www.spc.net.cn 电话：6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张0.5字数10千字 2009年5月第一版2009年5月第一次印刷 印数1-—2000 书号：155066·2-19744 SN/T2245—2009 前言 本标准等同采用经济合作与发展组织（OECD)化学品测试方法No.431(2004年04月）《体外皮肤 腐蚀人体皮肤模型试验》（英文版）。 本标准在标准文本格式上按GB/T1.1一2000做了下列编辑性修改： 一增加了范围部分； 一将OECD化学品测试方法No.431中有关方法的介绍、目的、范围等改为本标准的引言； 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准负责起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。 本标准参与起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国安徽出人境检验检 疫局、常州进出口工业及消费品安全检测中心。 本标准主要起草人：刘君峰、张少岩、卡学东、江红星、陈小卫、寇海娟、孙洪生。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2245—2009 引言 皮肤腐蚀是指皮肤在接触化学物质后产生的不可逆的皮肤组织损伤（如GHS中的定义）。本标准 提供了一种无需活体动物试验而对化学物质腐蚀性进行评估的试验方法。 评估腐蚀性通常需要进行实验室动物试验。GB/T21604一2008考虑到试验中动物的痛苦和疼 痛，在其附录中允许使用体外方法进行皮肤腐蚀性的测定，以避免动物的痛苦和疼痛。 完全代替GB/T21604一2008的主要困难是缺少正式的、独立的、科学的体外试验方法。前验证研 究可作为制定一种体内试验替代方法的第一步，随着这种研究的进行，已经开展了体外皮肤腐蚀性试验 方法的验证试验研究。这些研究导致了本试验和经皮电阻试验的产生。 研究表明采用人体皮肤模型的试验可以很好的区别已知的皮肤腐蚀性和皮肤非腐蚀性，而且还可 提供一些有关严重腐蚀性和轻微腐蚀性之间区别的信息。 本标准可以对腐蚀性化合物和混合物加以鉴定。如果结合其他已有的信息，（如pH，结构活性关 系，人类和(或)动物数据)通过证据权重分析，本标准还可以对非腐蚀性的化合物和混合物加以鉴定。 本标准通常不能提供受试物皮肤刺激的信息，也不能对腐蚀性物质按照GHS规则进一步加以分类。 为了全面评估皮肤在经皮一次染毒后的局部反应，建议按照GB/T21604一2008中的序贯试验策 略或GHS中提供的相关方法进行试验。 SN/T2245—2009 化学品体外皮肤腐蚀 人体皮肤模型试验 1范围 本标准规定了化学品体外皮肤腐蚀人体皮肤模型试验的原理、试验方法和程序。 本标准适用于化学品体外皮肤腐蚀人体皮肤模型试验。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T21604--2008化学品急性皮肤刺激性/腐蚀性试验方法 3术语与定义 以下术语和定义适用于本标准。 3. 1 体外皮肤腐蚀skincorrosioninvitro 皮肤接触化学物质4h后产生的不可逆的体外皮肤损伤，即表皮和真皮的可见性坏疽。腐蚀作用 的特征有溃疡、出血以及结痴，14d后皮肤因为发烫而变色，局部斑秃并结疤。应用组织病理学方法评 价可疑的损伤。 3.2 细胞活性cellviability 对细胞总活性（如细胞的线粒体脱氢酶还原MTT的能力）测量的参数，其取决于测量的端点和试 验的设计以及细胞的数量和活性。 4原理 受试物作用于一个三维的人体皮肤模型，所用皮肤模型至少包含一个具有角质层功能的改造上皮。 根据在特定作用时间内，细胞活性（如通过MTT还原法测定)降低到特定的临界值，米识别腐蚀性化学 物质。人体皮肤模型试验的原理是建立在假设腐蚀性化学物质能够通过扩散作用或腐蚀作用穿透角质 层，对其下面的细胞层产生细胞毒素作用的基础上。 5试验方法 5.1人体皮肤模型 实验室制备。使用人体皮肤模型必须满足本国和国际上伦理道德的要求。 5.1.2任何新的皮肤模型必须得到合法的认证（至少如5.3描述）。本试验所用的人体皮肤模型需满 足5.2和5.3中的条件。 5.2一般皮肤模型的条件 5.2.1应使用人体的角化细胞建造皮肤模型的上皮。功能性的角质层下面铺上多层上皮细胞，皮肤模 1 SN/T2245—2009 型可以具有一个基质层。多层角质层侧面添加必需的脂质，以防止毒素分子的快速渗透。 5.2.2皮肤模型的围堵结构可以阻止角质层周围的物质进入到下面的活性组织中。 5.2.3理想皮肤模型其角质层周围应不存在受试物进人活性组织的通道。皮肤模型应避免细菌（包括 支原体）和真菌的污染。 5.3功能性皮肤模型的条件 5.3.1细胞活性可用MTT法或其他代谢有关的染色法来量化。该试验中，从阴性对照组的皮肤组织 萃取或溶解的染料的光密度值(OD)至少是单独萃取溶剂的20倍。在整个染毒期内，阴性对照的皮肤 组织可以稳定存在培养基中（细胞活性保持恒定）。角质层应能完全阻止某些细胞毒索分子的快速渗透 （如1%TritonX-100）。此性能可以用细胞活性减半的暴露时间（ETs。）来评估（如EpiDermTM和 EPISKINTM模型，所需时间应大于2h）。 5.3.2该皮肤组织应适合在一定时间内在实验室再生，并且当该皮肤组织用于试验时，其必须能够检 测出表A.1中列出化学物质的腐蚀性。 6试验步骤 6.1染毒 6.1.1每个处理组（包括对照组)使用两个相同的皮肤组织。对于液体受试物，皮肤表面应均匀覆盖足 够多的受试物，最小量为25μL/cm²。 6.1.2对于固体受试物，皮肤表面应覆盖足够多的受试物。试验中，应用去离子水或蒸馏水润湿固体 受试物，再将其均匀覆盖到皮肤上，以保证固体受试物与皮肤接触充分。如果条件允许，固体受试物应 碾成粉末后使用。染毒的方式应适合于该受试物。试验最后阶段，要小心地用合适的缓冲液或0.9% NaC1溶液将受试物从皮肤表面洗去 6.1.3试验中需同时有阳性对照试验和阴性对照试验，以确保试验模型的正常运行。推荐用的阳性对 照物是冰醋酸或8mol/LKOH，阴性对照物是0.9%NaCl溶液或水。 6.2细胞活性的检测 6.2.1只有定量有效的检测方法才能被用于测量细胞活性，而且检测方法要与三维组织结构相一致。 非特异性染料的结合不能干扰细胞活性的检测。 6.2.2蛋白结合染料和那些不能经受任新陈代谢转变的染料（如中性红)是不适用的。最常用的方法 就是MTT[3-(4,5-二甲基-2-y1)-2,5-联苯四唑，噻唑基蓝；CASNo.298-93-1还原法。MTT还原法的 结果精确并具有可重复性，也可以用其他方法。 6.2.3将皮肤样品置于适当浓度（如0.3mg/mL1mg/mI)的MTT/溶液中，在适当温度下培养3h 后，用溶剂（异丙酮）萃取蓝色还原产物，在波长540nm～595hm范围内测定还原物的OD值。 6.2.4如果受试物没有通过清洗而从皮肤上完全除去，则受试物与染料发生的化学作用可能会模拟细 胞新陈代谢的情形，进而导致对细胞活性错误的判断。 6.2.5如果受试物直接作用于染料，则需要增加一个额外的对照组来检测并纠正受试物对细胞活性检 测的干扰。 7 数据与报告 7.1数据 每个组织的所得数据都要制成表格，包括：OD值、计算得到的细胞活性（百分比数值）、阳性对照组 和阴性对照组的数值，以及平行试验的数据（如果有），平均值和单个数值。 7.2报告 试验报告内容应包括。 1）受试物和对照组： 2 SN/T2245-—2009 化学名称（如IUPAC名称，CAS名称）和CAS号（如已知）； 化学物质或制剂的纯度和组成（质量分数）； -物理化学性质（如自然存在状态、pH、稳定性、水溶性及相关研究）； 试验开始前，对受试物和对照物的适当处理（如加热，研磨等）； 稳定性（如已知）。 2）说明所用皮肤模型的理由。 3）试验条件： 所用的细胞体系； 一对检测细胞活性的仪器（如分光光度计）进行校准的信息； -关于试验所用皮肤模型的全部支持信息（包括其有效性）； 试验步骤的细节； 使用的染毒剂量； 一对试验步骤做任何修正的描述； 一皮肤模型的历史数据的参考资料； 一评价标准的描述。 4）结果： 一每个试验样本的数据表格； -描述其他观察的结果。 5）结果的讨论。 6）结论。 7.3结果解释 每一个试验样本得到一个OD值，用该值和阴性对照相比得出的百分比来表示细胞相对活性（阴 性对照组的细胞相对活性一般视为100%）。用区别腐蚀性物质和非腐蚀性物质（或区别不同的腐蚀度 等级)的细胞活性的临界百分率或统计程序来评估结果和识别腐蚀性物质时，结果应该明确并做好记 录。通常情况