SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2102.3—2008/ISO 20837:2006 食源性病原体PCR检测技术规范 第3部分：定性检测方法样品制备要求 Polymerase chain reaction(PCR)for the detection of food-borne pathogens- Part 3: Requirements for sample preparation for qualitative detection [ISO 20837:2006, Microbiology of food and animal feeding stuffs- Polymerase chain reaction(PCR)for the detection of food-borne pathogens Requirements for sample preparation for qualitative detection,IDTJ 2009-02-01实施 2008-07-17发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 食源性病原体PCR检测技术规范 第3部分：定性检测方法样品制备要求 SN/T2102.3—2008/ISO20837:2006 中国标准出版社出版 北京复兴门外三里河北街16号 邮政编码：100045 网址www.spc.net.cn 电话：6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16印张1.25字数31千字 2008年9月第一版2008年9月第一次印刷 印数1-2000 书号：155066·2-19072 SN/T2102.3—2008/IS020837:2006 前言 SN/T2102《食源性病原体PCR检测技术规范》共分为四个部分： 第1部分：通用要求和定义； 第2部分：PCR仪性能试验要求； -第3部分：定性检测方法样品制备要求； 一第4部分：定性检测方法扩增和检测要求。 本部分为SN/T2102的第3部分。 本部分等同采用ISO20837:2006《食品与动物饲料微生物学食源性病原体PCR检测定性检 测方法样品制备要求》，并做了如下编辑性修改： 对“前言”和“引言”进行了修改； 对“规范性引用文件”的描述按照GB/T1.1的要求进行了修改； 将标准中的国际标准用相应的国家标准或行业标准替代，如：SN/T2102.1代替ISO20863； 将附录B.4.1中的试剂浓度改写为适用于中文的表达方式； 将“警告"改为“安全要求”，并放置到标准的末尾段； 在表A.1中加人了相应的国家标准； 删除了文后的参考文献部分。 本部分的附录A和附录B为资料性附录。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分由中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、中华人民共和国山西出入境检验检疫局、中华 人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局负责起草。 本部分主要起草人：王海艳、李卫华、高旗利、黄晓蓉、姚霞、刘宏、赵林立。 本部分系首次发布的出入镜检验检疫行业标准。 SN/T2102.3-2008/IS020837:2006 引 言 使用PCR技术检测食源性病原体常包括以下步骤： 样品的均质； 增菌和样品处理； 核酸的提取； 目标核酸扩增； - 一扩增产物检测。 ISO20837:2006由欧洲标准委员会（CEN)食品分析水平方法技术委员会（CEN/TC275)与食物 产品技术委员会（ISO/TC34)微生物小组委员会（SC9)依照ISO和CEN技术合作协议联合制定。 本部分等同采用ISO20837：2006，为《食源性病原体PCR检测技术规范》的第3部分，规定了以获 得质和量均适合定性PCR检测的样品或核酸为目的的样品制备要求。附录A列出了食品样品中细菌 增菌的标准方法。附录B通过实例介绍了特定样品的制备过程。 SN/T2102.3—2008/ISO20837:2006 食源性病原体PCR检测技术规范 第3部分：定性检测方法样品制备要求 1范围 SN/T2102的本部分规定了PCR样品制备的要求，用以获得质和量均适合定性PCR检测的样品 或核酸。 本部分适用于食品中病原体的PCR检测，必要时也可用于饲料、农产品/环境样品的PCR检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过SN/T2102的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 部分。 SN/T2102.1一2008食源性病原体PCR检测技术规范第1部分：通用要求和定义 3原则 3.1概要 样品制备方法的目的是获得质和量均适合PCR检测的样品或核酸。核酸的质量取决于所提取核 酸的化学纯度、分子平均长度以及结构完整性。增菌和样品处理结果应以检测到少量的目标微生物并 减少PCR抑制物质为目的。采用对核酸完整性破坏程度最低的物理、化学或生化操作，以获得适合 PCR扩增的样品或核酸溶液。 3.2增菌和样品处理 可以对不经增菌培养的样品直接进行样品处理，也可以根据附录A中所列标准或其他适宜标准在 对样品进行增菌培养后再进行处理 3.3核酸提取 核酸提取的基本原理包括释效细菌中的-DNA以及同时或随后去除PCR抑制物质。附录B中给 出了一种DNA提取/纯化方法的系例。本方法仅作为示例，使用者可,以进一步改进以满足不同实验室 的需要。 4通用实验室要求 应按照SN/T2102.1一2008中6.3的规定，在独立工作区或工作间内对样品进行处理。 5试剂、仪器和设备 参见本标准附录A和附录B及SN/T2102.1。 6操作程序 6.1细菌的增菌和样品处理 6.1.1增菌 应按照适宜标准中推荐的培养基对食品样品进行增菌培养。也可以使用其他更适合的增菌培养 SN/T2102.32008/IS0208372006 基，但这些培养基的增菌效果至少不应低于表A.1国际/国家标准中培养基的增菌效果。推荐使用表 A.1中国际标准中的增菌培养基，这些培养基中含有较少的PCR抑制物。当无法获得国际标准时，也 可使用表A.1国家标准中的培养基或其他类似产品，但应尽量避免使用抑制剂含量高的增菌培养基。 对于特殊产品，应注意抑制竞争性背景微生物的生长（如：加人选择性化学物质或抗生素）。 6.1.2细菌的处理 可以尝试采用最低破坏程度的方法，如简单的稀释、离心、蛋白消化、过滤、密度离心、免疫磁性分离 等。如上述方法无法提取到细菌DNA，可使用煮沸、加入螯合剂或烈性化学试剂（如：三氯甲烷和乙醇） 等更为剧烈的方法或使用相应的试剂盒提取。可使用简单的物理方法降低高脂样品中的脂肪成分。可 使用整合剂降低奶制品中有抑制作用的高钙成分。 6.2核酸提取 6.2.1DNA提取 6.2.1.1DNA的释放和纯化 可以将几个DNA提取原理结合起来使用。例如，可以采用下列步骤进行提取： a）用蛋白酶（如：蛋白酶K)降解细胞提取物中的蛋白质，用核糖核酸酶降解RNA； 用有机溶剂（如：苯酚和三氯甲烷混合物)沉淀所产生的肽类物质，将DNA留在水相； b) c） 在单价阳离子存在的情况下，用乙醇进一步浓缩纯化DNA溶液； d）通过离心收集沉淀的DNA； e）DNA经乙醇清洗后，重新悬于缓冲液中（如：Tris-EDTA缓冲液或Tris缓冲液）。 为了提高DNA的回收率，在沉淀步骤中可以使用肝糖原、聚乙二醇（PEG)或转运RNA（t-RNA） 等DNA协同沉淀物。只有不含任何核酸酶活性、PCR抑制/竞争物质以及任何与被检PCR目标片段 同源序列物的DNA协同沉淀物才可以用于PCR。 注：使用真空冷冻干燥器对沉淀后获得的DNA沉淀物进行干燥可能造成交叉污染。 可使用细胞热处理方法（如：煮沸10min）释放DNA。将样品煮沸后，冷却、离心，取上清液用于 PCR。煮沸前进行酶处理（如：溶菌酶、变溶菌素可用于革兰氏阳性菌），再加人蛋白酶进行温育消化.可 促进细胞裂解。对于具有坚韧细胞壁的细菌（如：分枝杆菌属的细菌），需要使用其他方法，如加入磁珠 剧烈摇动。包括试剂盒在内的其他方法，当其核酸提取效果不亚于上述方法时，也可以用于核酸提取。 6.2.1.2DNA的质和量 a）当检测物中存在足够数量的DNA时，采用指定方法从指定检测物中提取的用于PCR反应的 DNA的质和量应具有重复性和再现性。所用方法提取的DNA片段的平均长度应该大于或 等于被测PCR产物； b）可通过荧光法或凝胶电泳法评估提取DNA的浓度和纯度。分光光度法可对纯化的DNA进 行定量； 琼脂糖凝胶电泳并经溴化乙锭染色后根据紫外灯下凝胶中的荧光能快速评估DNA质和量； d）煮沸等核酸制备方法得到的核酸不稳定，制备后应立即使用； e）应避免对核酸溶液反复冻融； f）应使用适宜的塑料器血储存低拷贝的核酸。 注：一些试管材料可能吸附核酸。 6.3质控对照 应依据SN/T2102.1一2008中9.3和表1的规定使用质控对照。 7安全要求 本部分在使用过程中可能接触到试剂、操作和仪器所带来的危害，文中不再对其使用过程中的所有 安全问题进行陈述，使用者最好建立安全和健康规定，并在使用本部分前确定适当的安全限制。 2 SN/T2102.32008/IS020837:2006 附录A （资料性附录） 与微生物（细菌)增菌有关的标准 表A.1 一些微生物（细菌）的专用标准 细 蘭 国际标