SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2102.2—2008/IS0/TS20836:2005 食源性病原体PCR检测技术规范 第2部分：PCR仪性能试验要求 Polymerase chain reaction(PCR)for the detection of food-borne pathogens Part 2:Performance testing for thermal cyclers [ISO/TS 20836:2005,Microbiology of food and animal feeding stuffs- Polymerase chain reaction(PCR)for the detection of food-borne pathogens Performance testing for thermal cyclers,IDTJ 2008-07-17发布 2009-02-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2102.2—2008/ISO/TS20836:2005 前 言 SN/T2102：《食源性病原体PCR检测技术规范》共分为四个部分： 第1部分：通用要求和定义； 第2部分：PCR仪性能试验要求； 第3部分：定性检测方法样品制备要求； 第4部分：定性检测方法PCR扩增要求。 本部分为SN/T2102的第2部分。 本部分等同采用ISO/TS20836：2005《食品与动物饲料微生物学食源性病原体PCR检测PCR 仪性能试验要求》，并做了如下编辑性修改： 对“前言”和“引言”进行了修改； 对“规范性引用文件”的描述按照GB/T1.1的要求进行了修改； 将标准中的国际标准用相应的国家标准或行业标准替代，如：GB/T27025代替ISO17025； 将第A.3章中试剂浓度的表述方式改为中文表述方式； 将“警告”改为“安全要求，并放置到标准的末尾段； 删除了标准后的参考文献。 本部分的附录A和附录B均为资料性附录。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分由中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山西出人境检验检疫局、中华人民共和国上海 出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、 中华人民共和国山东出人境检验检疫局负责起草。 本部分主要起草人：李卫华、赵贵明、李晓虹、王振国、许龙岩、雷质文、邹明强、刘守贤。 本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 建筑321---标准查询下载网 www. jz321. net SN/T2102.22008/ISO/TS20836:2005 引言 聚合酶链式反应(PCR)具有快速、灵敏和特异的优点，利用PCR技术进行食源性微生物的检测方 法近年来发展十分迅速。 目前，PCR仪在技术方面已十分完，但因受珀耳帖效应及制作工艺的影响，加热、冷却元器件具 有一定的使用寿命，这些元器件的正常功能取决于其本身质量以及正确的使用与维护。为此，进行 PCR仪的日常维护仍十分必要。 ISO/TS20836：2005，由欧洲标准委员会（CEN)食品分析水平方法技术委员会（CEN/TC275） 与食物产品技术委员会（ISO/TC34)微生物小组委员会（SC9)依照ISO和CEN技术合作协议联合 制定。 本部分等同采用ISO/TS20836：2005，为《食源性病原体PCR检测技术规范》的第2部分。规定了 PCR仪（包括制冷/加热元件)安装、使用与维护的一般原则。资料性附录A和附录B中规定了PCR仪 性能试验的生化和物理方法。 SN/T2102.2-2008/IS0/TS20836:2005 食源性病原体PCR检测技术规范 第2部分：PCR仪性能试验要求 范围 SN/T2102的本部分确立了PCR仪的安装、使用、维护的基本要求，规定了PCR仪性能试验的生 化和物理方法。PCR仪的制冷/加热元件都有规定的使用寿命，其正常功能的发挥不仅取决于设计的 质量，也取决于正确的使用和维护。 本部分适用于PCR仪的生化和物理性能试验。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过SN/T2102的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成 ·协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 部分。 GB/T27025检测和校准实验室能力的通用要求 SN/T2102.1食源性病原体PCR检测技术规范第1部分：通用要求和定义 3术语和定义 SN/T2102.1确立的以及下列术语和定义适用于SN/T2102的本部分。 3. 1 热盖heatlid PCR仪上防止反应管中反应液蒸发的装置。 3. 2 温度均匀性temperatureuniformity 温控装置（如加热模块中）内温度的均匀性。 3. 3 生物化学性能试验biochemicalperformancetest 通过生物化学方法（如温度敏感PCR反应）测定PCR仪性能的试验程序。 3.4 物理性能试验physicalperformancetest 通过物理方法测定PCR仪性能的试验程序。 3.5 非精确PCR体系non-robustPCRsystem 因偏离预定的PCR化学或温度控制程序而导致扩增效果减弱的PCR体系。 3.6 临界位置criticalposition PCR仪多孔反应板中样品的实际温度与显示温度易发生偏离的位置或区域。 4PCR仪的安装 按照生产商说明书中的要求进行安装应在适宜的温度（5℃～40℃）和湿度（相对湿度≤80%)环境 1 建筑321---标准查询下载网 www. jz321. net SN/T2102.2—2008/IS0/TS20836:2005 中安装和运行PCR仪。并应将PCR仪放置在符合以下条件的位置： 便于检查； 一便于PCR仪与环境之间稳定的热交换和空气流通； 一稳定的环境。 5PCR仪的维护 6性能试验 6.1概述 利用间接的生化方法或直接的物理方法对PCR仪的性能进行试验并记录。 6.2生化试验法 应使用对温度敏感的PCR反应对PCR仪进行生化性能试验。附录A为生化试验的实例，其他满 足要求的PCR方法均可使用。应根据仪器的使用时间和运行次数确定每台PCR仪的试验频率。 6.3物理试验法 物理试验法是测量PCR仪每个样品反应孔在热循环过程中的实际温度并与显示温度进行对比的 方法。附录B为物理试验的实例。当PCR仪无法进行生化试验或生化试验显示无扩增效果时，应进行 物理试验，并根据使用时间和运衍次数确定每台PCR仪的试验频率 试验报告和非正常情况的记录 实验室应建立文件控制程序，用来确认和描述PCR仪的异常情况（详见GB/T15481）。试验报告 应符合GB/T27025的要求，且至少应包括以下内容： 被试验PCR仪的编号； 用于试验的方法； 试验日期； 试验分析负责人； 试验结果； 一试验过程中观察到的具体细节： 一所有与试验标准偏离的情况； 其他与试验有关的信息 8安全要求 本部分未列出使用中涉及到的所有安全间题。操作者在使用本部分时可能受到由有害物质、仪器 设备和操作不当所造成的危害，实验室管理者应预先建立适宜的安全健康规定，以避免危害的发生。 SN/T2102.2—2008/IS0/TS20836:2005 附录A （资料性附录） 生化性能试验一 测量温度准确度的PCR方法 A.1概述 该方法用于试验PCR仪对退火温度控制的准确度，所用试验方法对预设温度与实际退火温度的差 异十分敏感。 A.2原理 A.2.1利用预先设计的PCR反应对PCR仪预设/显示温度的准确度进行试验。PCR样品对PCR反 应过程中退火温度的升高十分敏感。 A,2.2使用标准的M13测序引物对pGEM载体克隆位点的旁侧区域进行扩增，得到362bp含PCR 目标位点的DNA序列。其克隆序列见图A.1 CAGGAAACAG CTATGACCAT GATTACGCCA AGCTATTTAG GTGACACTAT AGAATACTCA AGCTATGCAT CCAACGCGTT GGGAGCTCTC CCATATGGTC GACCTGCAGG CGGCCGCAC AGTGATTAGC AACCTCGGTA CCATATACTA ACTCGATACA" GAAACATCGG TTGGTGATCG ATCGAGGTTT TTAAAAACCC CCTCTAGCTA GCTAGCTAGC GATTGCTTCA CCAAGAAGAG CTCCAACAGC CTGATGGCAT CAAGTTACAC AATCCCGCGG CCATGGCGGC CGGGAGCATG GTCGTATTAC AATTCACTGG CCGTCGTTTT AC CGACGTCGGG CCCAATTCGC CCTATAGTGA 图A.1~用于PCR试验的模板和引物序列 A.2.3上述序列为使用M13引物（图中双线部分)扩增改进的pGEM质粒（即pSC17)中的目标序列 所得到的。图中阴影部分为验证试验的引物（分别命名为VAL1和VAL2，见A.3.5.3和A.3.5.4)， 单划线部分为扩增的PCR产物“T"（方框圈示）为一个错配碱基。 注：可使用任何与pGEM质粒等效的质检（或DNA序列)进行试验） A.2.4，用琼脂糖凝胶方法能够检测到表明引物VAL1和VAL2扩增得到的116bp的PCR产物。由 于引物VALI3*端的错配(T与C)，使RCR/反应对高于预设温度的实