SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1687-2005 马流感血凝抑制试验操作规程 Protocol of haemagglutination inhibition test for equine influenza 2005-09-30发布 2006-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1687—2005 前 言 本标准参考了OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》2004版。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：张利峰、张鹤晓、刘继红、谷强。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 I SN/T 1687—2005 马流感血凝抑制试验操作规程 1范围 本标准规定了马流感血凝抑制试验方法。 本标准适用于马流感病毒(H)亚型的鉴定，及其由马流感病毒引起的马流感的诊断、流行病学调 查、检疫和监测。 2缩略语 下列缩略语适用于本标准。 2. 1 HA 血凝试验 2. 2 HI 血凝抑制试验 2. 3 PBS 磷酸盐缓冲液 2. 4 RBC 红细胞 3材料准备 3.1 器材 V型96孔微量滴定板、微量移液器、采血管、微量混合器、离心机。 3.2抗原 马流感病毒亚型1(H7N7)和马流感病毒亚型2(H3N8），由国家有关主管部门认可的或指定的供 应商提供，处理方法见第A.3章。 3.3鸡红细胞 鸡红细胞的准备见第A.4章。 3.4血清 3.4.1标准阳性血清 由国家有关主管部门认可的或指定的供应商提供。 3.4.2被检血清采集及前处理 在马颈部上三分之一处静脉采血10mL，分离血清并处理后用于检测，马血清前处理方法见第A.5 章，若需较长时间检测，可置于4℃或一20℃。 4操作方法 4.1微量血凝试验(HA) 4.1.1取干净的V型96孔微量滴定板一块，按表1进行操作：每孔加25μLPBS液；孔1加人前处理 过的马流感病毒抗原25μL，用微量移液器反复吹打混匀；吸出25μL于孔2，吹打混匀后吸出25μL于 孔3，如此依次按1：2倍比稀释到孔11，第11孔弃去25μuL，最后1孔不加抗原作对照。 4.1.2抗原稀释完后，每孔补加PBS25μL。孔12不加抗原，只加PBS液做空白对照。 4.1.3每孔加人50μL1%鸡红细胞悬液，轻轻振荡混匀，在适宜温度22℃左右静置作用30min，HA 1 SN/T1687—2005 滴度为红细胞出现凝集的最高稀释倍数。抗原血凝滴度的测定应设置4个重复，取其中位值。 马流感血凝试验 单位为微升 表 1 10 11 12 孔号 6 2 3 4 5 1:1024 1 : 2 048 对照 1:1281:256|1:512 抗原稀释度 1 : 2 1: 8 1 : 16 1 : 32 11 4 1: 64 25 25 25 25 50 PBS液 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 抗原 50 50 50 50 50 1%红细胞 50 50 50 50 50 50 在适宜温度22℃左右静置作用30min 判定举例 注：马流感抗原的血凝滴度为红细胞出现凝集的最高稀释倍数。因此，能使红细胞出现凝集的最高稀释倍数的病 毒液25μL称为1个血凝单位（HA)。如某马流感抗原的血凝滴度是1：128,那么1：128稀释的该病毒抗原 25μL即为1个HA单位。在进行马流感血凝抑制试验时，病毒抗原的工作浓度应为4个HA单位。如果该病 毒抗的工作浓度为1：32，那么25μL1：32的稀释抗原含有4个HA单位。 4.2 血凝抑制试验(HI) 4.2.1取干净的96孔微量滴定板一块，按表2进行操作：每孔加25μLPBS。 4.2.2孔1加待检血清25μL，用微量移液器反复吹打混匀；吸出25μL于孔2，吹打混匀后吸出25μL 于孔3，如此依次稀释到孔10。孔10混匀后吸出25μuL弃掉。最后2孔不加血清，分别做抗原对照和 不加血清的空白血凝对照。 4.2.3 稀释抗原，含量为4个HA单位（4×最小凝集量，即滴度/4)。 4.2.4 每孔中加25μL抗原，充分振荡后，在适宜温度22℃左右静置作用30min。 4.2.5 每孔加50μL1%鸡红细胞液，充分振荡后，在适宜温度22℃左右静置作用30min。 4.2.6 将滴定板倾斜70°判读结果。 马流感血凝抑制试验 单位为微升 表 2 孔号 10 11 12 6 空白 抗原 1 : 16 1: 32 1 : 64 1:1281:2561:512 11:1024 血清稀释度 1 2 1 : 4 1: 8 对照 对照 25 25 25 50 75 PBS液 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 待检血清 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 4HA抗原 25 在适宜温度22℃左右静置作用30min 50 50 50 50 1%红细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 在适宜温度22℃左右静置作用30min 判定举例 马流感病毒感染或免疫的马血清能抑制马流感病毒对红细胞的凝集作用。凡能使4个HA单 4.2.7 位的抗原凝集红细胞作用完全被抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的血凝抑制价（如表2的血凝抑 制价为1：32)。 2 SN/T 16872005 5判定标准 5.1判定时应首先观察各对照孔是否成立。 5.2红细胞凝集：红细胞分散在孔底四周呈均匀的颗粒状凝集且布满整个孔底，判为血凝作用为阳 性“+”。 5.3无凝集或凝集抑制：红细胞集中于孔底中央呈点状，将96孔微量滴定板倾斜70°判读结果时红细 胞向下流，判血凝作用为阴性“二”，或判血凝抑制作用为阳性“十”。 5.4血凝抑制价：凡能使4个HA单位的抗原凝集红细胞作用完全被抑制的血清最高稀释倍数，称为 该血清的血凝抑制价。 5.5被检马间隔14d～20d采集的双份马血清经白陶土悬液处理后，血凝抑制价升高2个或2个滴度 以上者，判定该匹马近期感染马流感病毒。 5.6红细胞凝集现象被抑制的孔，判为血凝抑制反应阳性；最后判定时间与感作温度有关，温度高时感 作时间较短；温度低时可适当延长。 SN/T1687—2005 附录A (规范性附录） 试剂配方和前处理方法 A. 1 阿氏液（Alsever's)配方 葡萄糖 2. 05 g 枸檬酸钠 0.8 g 0. 055 g 枸橡酸 0. 42 g 氯化钠 去离子水 加至100mL 上述成分混合后加微热溶解，过滤，以0.053MPa20min灭菌，4℃保存备用。 A.2PBS缓冲液配方 A液0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液：NaHzPO.·HzO27.6g，溶于蒸馏水中，最后稀释至1000mL 备用。 B液0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液：NazHPO,·7Hz053.6g（或Na2HPO。·12H,O71.6g或 Na2HPO4·2Hz035.6g)加蒸馏水溶解，最后加水至1000mL备用。 0.01mol/LpH7.4的PBS缓冲液的配制：取A液19.0mL，加人B液81.0mL，为0.2mol/LPB。 再加水至2000mL，则成为pH7.4的0.01mol/L的PBS。 A.3马流感抗原前处理方法 马流感抗原前处理方法： a）分别在40mL的马流感病毒鸡胚尿囊液中加人0.5mL含10%吐温-80的PBS（体积分数）， 使吐温-80的浓度为0.125%（体积分数）。 b）# 在室温下轻轻混匀5min，然后加入20mL乙醚，使终浓度为33.3%（体积分数），充分混匀后， 放置在4℃15min。 c）静置分层，将液相层（含有破裂病毒粒子的水层)移入玻璃瓶，松开瓶盖，过夜，让过量的乙醚在 4℃下挥发。 A.4鸡红细胞准备方法 无菌采集成年公鸡血液，加人到等量阿氏液中摇匀，置4℃冰箱中保存备用。临用前，用20倍体积 的0.01mol/LPBS(pH7.4)洗涤3次~4次，每次3000r/min离心5min~10min，将血浆、白细胞充 分洗去至上清液清亮，再将沉淀的红细胞用PBS缓冲液稀释成1%的红细胞悬浮液(RBC)。 SN/T1687—2005 A.5 5被检血清前处理方法 被检马血清前处理方法：用PBS将马血清做1：5稀释，加人等体积的白陶土悬液混匀，4℃孵育 20min（期间混匀2次～3次），4℃1000r/min离心15min，收集上层血清，得到原血清1：10的稀释 液，此稀释血清用于血凝抑制试验，检测抗体滴度。 5