SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4283.2—2015 国境口岸微孔板基因芯片检测方法 第2部分：结核分枝杆菌及katG 和 rpoB耐药变异基因 Test method of microplate gene chip at frontier port- Part 2: Mycobacterium tuberculosis and drug resistant 行业标准信息服务平台 mutations of katG and rpoB genes 2015-05-26发布 2016-01-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4283.2—2015 前 言 SN/T4283《国境口岸微孔板基因芯片检测方法》为系列标准，分为六个部分： 第1部分：通用技术规程； 第2部分：结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因； 第3部分：7种呼吸道病毒； 一第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型； 第5部分：肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌； 第6部分：12种食源性致病菌。 本部分为SN/T4283的第2部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、深圳市南 山区慢性病防治院、珠海精标仪器有限公司。 本部分主要起草人：刘春晓、杨燕秋、张涛、张树平、刘君、顾大勇、史蕾、赵纯中、何建安、徐云庆、 李永进。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4283.2—2015 国境口岸微孔板基因芯片检测方法 第2部分：结核分枝杆菌及katG 和rpoB耐药变异基因 1范围 SN/T4283的本部分规定了国境口岸结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因的微孔板基因 芯片检测方法 本部分适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术对结核分枝杆菌及katG和rpoB两个 耐药变异基因进行检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1262国境口岸结核病检验规程 SN/T2752.4—2011卫生检疫人员的自我防护规范第4部分：实验室人员 SN/T3312结核分枝杆菌-干扰素体外检测方法 SN/T4283.1国境口岸微孔板芯片检测方法第1部分：通用技术规程 WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 3术语和定义 SN/T4283.1和SN/T1262、SN/T3312界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 耐药变异基因drug resistant mutations 由于发生碱基的插人、缺失、置换等而导致耐药产生的基因。耐药基因变异是结核分枝杆菌产生耐 信息服务平 药性的主要机制。 3.2 katG基因katGgene 过氧化氢酶-过氧化物酶（catalase-peoxidase)的编码基因 3.3 rpoB基因rpoBgene 结核杆菌DNA依赖RNA聚合酶（DNA-dependentRNApolymerase，DPRP）β亚单位的编码 基因。 4缩略语 SN/T4283.1界定的以及下列缩略语适用于本文件。 1 SN/T 4283.2—2015 KatG：过氧化氢酶-过氧化物酶（catalase-peroxidase） rpoB:RNA聚合酶β亚单位(RNApolymerase beta-subunit) MTB：结核分枝杆菌（mycobacteriumtuberculosis） WT：野生型（wildtype) 5生物安全防护要求 5.1实验室应遵循GB19489和WS233对应的生物安全要求。 5.2实验人员的防护遵循SN/T2752.4—2011的要求。 6主要设备和试剂 6.1主要设备：基因芯片点样仪、芯片杂交仪、芯片清洗显色仪、生物芯片全自动扫描判读仪、PCR仪、 生物安全柜、离心机、移液器、恒温水浴锅等。 6.2主要试剂：结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测试剂盒或自行设置结核分 7检测流程 7.1样品核酸的提取 7.1.1痰液等标品DNA的提取如下：吸取痰液干酪样或脓性黏液部分（或胸水、肺泡灌洗液、浑浊的脑 脊液离心后取沉淀物）2mL于无菌尖底离心管内，加人等量临用前新鲜配制的消化液（4%NaOH 50mL+2.94%柠檬酸钠50mL+N-乙酰-L半胱氨酸0.5g，充分溶解混匀），置涡旋混均器上混匀 15s~20s，室温静置15min，使之充分液化至清亮。加人无菌pH6.8PBS缓冲液至20mL，混匀， 3000g离心15min，弃去上清液。于沉淀中提取样品DNA，可参照SN/T4283.1。 7.1.2培养的菌落样品DNA可直接提取，参照SN/T4283.1。 7.2PCR扩增反应 7.2.1可使用试剂盒附带的试剂按说明书要求配置PCR反应体系，或自行配置25μLPCR反应体系： 10×PCR缓冲液2.5μL，dNTPs（各5μmol/L）2μL，MgClz（25mmol/L）2μL，所有上下游引物（含 PCR阳性对照）（各5μmol/L）混合液2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，模板核酸5μL（含阳性对照核酸 1μL，主要为细菌基因组DNA)，ddHzO11.25μuL；振荡混匀，并轻微离心。 7.2.2将上述PCR反应管放入PCR仪，设定PCR反应程序：首先95℃变性5min；然后95℃变性 30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min，4保存备用；若需长期使用请 置于一20℃保存。 7.3微孔板基因芯片杂交反应 7.3.1开启芯片杂交仪，并设置芯片杂交仪预加热至50℃。 7.3.2按试验要求准备所需的微孔板基因芯片，并准确、清晰标记。将杂交反应液平衡至室温，轻轻摇 应液均勾覆盖于芯片检测表面并且无气泡产生，如有气泡可以用洁净的细针或加样枪头去除。 2