ICS 65.100 G 24;G 25 HG 中华人民共和国化工行业标准 HG 3617—1999 苏云金杆菌可湿性粉剂 Bacillus thuringiensis wettable powder 1999-06-16发布 2000-06-01实施 国家石油和化学工业局发布 HG 3617—1999 前 言 本标准是根据我国以往制定的苏云金杆菌企业标准等有关材料，结合我国实际情况而制定的。 本标准对苏云金杆菌可湿性粉剂的要求、试验方法、抽样以及包装、运输等作了具体要求和规定，从 而为苏云金杆菌的生产提供了统一的技术依据。 本标准由中华人民共和国原化学工业部技术监督司提出。 本标准由化学工业部沈阳化工研究院归口。 本标准主要起草单位：中国农业大学应用化学系。 本标准参加起草单位：湖北省生物农药工程研究开发中心、济南科贝尔生物工程有限公司。 本标准主要起草人：刘丰茂、王开梅、钱传范、钟连胜、赵欣昕、王绮文。 I 中华人民共和国化工行业标准 HG 3617—1999 苏云金杆菌可湿性粉剂 Bacillus thuringiensis wettable powder 苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis，B.t.）是目前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的主要杀虫 成分是伴孢晶体中的毒素蛋白，其中，对鳞翅目有毒力的蛋白相对分子质量为130000。 范围 1 本标准规定了苏云金杆菌可湿性粉剂的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运。 本标准适用于由苏云金杆菌原药和助剂等制成的苏云金杆菌可湿性粉剂，主要用于防治鳞翅目害 虫。 2引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所有版本均 为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 GB/T1250一1989极限数值的表示方法和判定方法 GB/T1600—1979(1989）农药水分测定方法 GB/T1601—1993农药pH值的测定方法 GB/T1604—1995商品农药验收规则 GB/T1605—1979（1989）商品农药采样方法 GB3796—1983农药包装通则 GB/T5451一1984农药可湿性粉剂湿润性测定方法 GB/T14825—1993 3农药可湿性粉剂悬浮率测定方法 GB/T16150—1995 农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法 HG3616—1999 苏云金杆菌原粉 3要求 3.1外观：灰白色至棕褐色疏松粉末，不应有团块。 3.2苏云金杆菌可湿性粉剂应符合表1要求。 表1苏云金杆菌可湿性粉剂控制项目指标 指 项 目 32 000 IU /mg 16 000 IU /mg 8 000 IU /mg 毒素蛋白，% ≥ 4. 0 2. 0 1. 0 毒力效价（[PxIU/mgJ[HaIU/mg]) 32 000 16 000 8 000 pH值 6. 0~7.5 细度（75μm），% ≥ 86 国家石油和化学工业局1999-06-16批准 2000-06-01实施 1 HG3617—1999 表1 (完) 指 标 项 目 32 000 IU /mg 16 000 IU /mg 8 000 IU /mg 悬浮率(有效成分)，% 70 湿润时间，min 8 水分，% 4. 0 注：Px和Ha分别为小菜蛾(Plutellaxylostella）和棉铃虫(Heliothisarmigera）的缩写。 4试验方法 除另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液。 4.1抽样 按照GB/T1605一1979（1989）中第五章粉剂和可湿性粉剂的采样进行，用随机数表法确定抽样 的包装件。最终抽样量应不少于100g。 4.2鉴别试验 当用生物测定法检测产品质量产生疑问时，可用以下方法进行鉴定。 用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法测定有效毒素蛋白的相对分子质量是 否为130000,并同时测定毒素蛋白含量是否符合3.2指标的规定。 4.3毒素蛋白含量的测定 毒素蛋白含量可以用SDS-PAGE-扫描法和SDS-PAGE-洗脱比色法两种方法进行测定，二者精密 度、准确度接近，前者由于自动化程度更高，而定为仲裁法。 4.3.1SDS-PAGE-扫描法（仲裁法） 4.3.1.1方法提要 用碱性溶液处理苏云金杆菌可湿性粉剂伴孢晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过SDS-PAGE，依 蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，之后用薄层扫描仪或电泳图像扫描仪扫描 蛋白区带面积，进行定量。 4.3.1.2仪器、设备 电泳仪。 夹芯式垂直电泳槽（1.5mm凹形带槽橡胶模框）、凝胶板面积145mm×100mm（1.5mm、12孔样 品槽模具）。 高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪。 离心机：10000/min。 分析天平：精确至0.0001g。 4.3.1.3试剂和溶液 过硫酸铵(AP）。 十二烷基硫酸钠(SDS)。 四甲基乙二胺(TEMED)。 氢氧化钠。 30%丙烯酰胺：称取丙烯酰胺30g，亚甲基双丙烯酰胺（原称：甲叉双丙烯酰胺)0.8g，溶于100mL 蒸馏水中，过滤，于4℃暗处贮存备用。 1mo1/L、pH8.8三羟基甲基氨基甲烷-HC1缓冲液：称取三羟基氨基甲烷30.25g溶于蒸馏水中， 用浓盐酸调至pH8.8，用蒸馏水定容至250mL。 1mo1/L、pH6.8三羟基氨基甲烷-HC1缓冲液：称取三羟基氨基甲烷12.10g溶于蒸馏水中，用浓 2 HG3617—1999 盐酸调至pH6.8，用蒸馏水定容至100mL。 电极缓冲液：称取三羟基氨基甲烷3.03g，甘氨酸14.42g，十二烷基硫酸钠1g，用蒸馏水溶解并定 容至1000mL。 3×样品稀释液：1mo1/L、pH6.8三羟基氨基甲烷-HC118.75mL，十二烷基硫酸钠6g，甘油30 mL，基乙醇15mL，少许溴酚蓝，用蒸馏水定容至100mL。 染色液：称取考马斯亮蓝（CBB)R-2501g，加入甲醇450mL，冰乙酸100mL，蒸馏水450mL，溶解 过滤后使用。 脱色液：量取甲醇100mL，冰乙酸35mL，用蒸馏水定容至1000mL。 漂洗液：量取无水乙醇30mL，冰乙酸10mL，蒸馏水60mL，混合均匀后使用。 毒素蛋白标样：毒素蛋白（相对分子质量为130000)含量为9.3%的原粉。 4.3.1.4试样处理 称取标样、试样各20mg（准确至0.1mg），移至5mL离心管中，加2mL水充分悬浮。然后加入 0.55mol/L氢氧化钠溶液0.45mL（使氢氧化钠溶液的终浓度为0.1mol/L），放置约5min，再加入 3×样品稀释液1.30mL，使最终体积为3.75mL，于100℃沸蒸馏水中煮6min，离心（2000r/min）10 min后取上层清液，以备电泳上样。 4.3.1.5SDS-PAGE分离毒素蛋白 a）制备8%10%聚丙烯酰胺凝胶 采用不连续缓冲系统，制胶方法见HG3616一1999附录A（提示的附录）。 b）上样 取上述标样溶解上层清液，于聚丙烯酰胺凝胶的上样孔中分别上样6、8、10、12、14μL（毒素蛋白含 量约为3～7μg），作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液（毒素蛋白含量约为5μg），加入到 上样孔中，注入电极缓冲液后，接通电源。 ）电泳 电泳初期电压控制在100V左右，待试样进入分离胶后，加大电压到120V，继续电泳，当指示剂前 沿到达距底端1cm左右时停止电泳，取出胶板，在7.5%（体积百分数）乙酸中浸泡30min。 d）染色 将分离胶部分取下，用考马斯亮蓝(CBB)R-250染色液染色过夜。 e）脱色 倒去染色液，先用漂洗液洗涤凝胶，然后加入脱色液，于37℃下加热使其脱色，更换几次脱色液，直 至背景清晰为止。 4.3.1.6测定 胶板经脱色后，可清晰地看到130000蛋白区带，用高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪扫描该 区带，扫描波长为600nm。 样品中毒素蛋白的百分含量(X)按式(1)进行计算。 m,V2 X=n X 100 (1) m2V1 式中：m1——从标准曲线上查得的样品中毒素蛋白的量，ug； m2——2mL稀释液中样品的质量，mg； V1一样品最终定容体积，mL（3.75mL）； V2——注入凝胶上样孔的样品体积，uL。 4.3.1.7允许差 取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于8%。 4.3.2SDS-PAGE-洗脱比色法 8 HG3617—1999 4.3.2.1方法提要 用碱性溶液处理苏云金杆菌可湿性粉剂伴孢晶体，使其降解为毒素蛋白后，通过SDS-PAGE，依蛋 白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，再割胶，洗脱，测定吸光度。 4.3.2.2仪器、设备 分光光度计。 其他同4.3.1.2。 4.3.2.3试剂和溶液 吡啶。 其他同4.3.1.3。 4.3.2.4试样处理 同4.3.1.4。 4.3.2.5SDS-PAGE分离毒素蛋白 a）制备8%10%聚丙烯酰胺凝胶 同4.3.1.5a)。 b）上样 取上述标样溶液上层清液，于上样孔中分别上样15、20、30、40、50μL（毒素蛋白含量约为7.5～25 ug）。作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液（毒素蛋白含量约为15ug），加入到上样孔中， 注入电极缓冲液后，接通电源。 c）电泳 同4.3.1.5c)。 d）染色 同4.3.1.5d)。 e）脱色 同4.3.1.5e)。 4.3.2.6测定 用手术刀刮下待测区带，放于玻璃试管中，再加25%吡啶（体积百分数）3.0mL，于