ICS 11.220 SB B 41 备案号：24730—2008 中华人民共和国国内贸易行业标准 SB/T10463—2008 猪肺炎支原体检验方法 Methods for the detection of mycoplasmal pneumonia of swine 2008-12-01实施 2008-07-03发布 中华人民共和国商务部 发布 SB/T 10463-2008 前言 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由中华人民共和国商务部提出并归口。 本标准由中华人民共和国商务部屠宰技术鉴定中心负责起草。 本标准主要起草人：赵志云、金社胜、郑志明。 SB/T10463—2008 猪肺炎支原体检验方法 1范围 本标准规定了猪支原体肺炎的检验方法。 本标准适用于生猪屠宰过程中猪支原体肺炎的实验室检验。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 猪支原体肺炎 mycoplasmalpneumoniaofswine 由猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae）感染引起猪的一种接触性传染病。以气喘和咳嗽、 患猪长期生长缓慢发育不良、肺门淋巴结呈髓样肿胀，淋巴组织显著增生为特征。 4设备和材料 4.1过滤器：300nm孔径。 4.2剪刀、镊子。 4.3 锥形瓶：1000mL。 4.4 均质器或灭菌乳钵。 4.5 注射器：1mL（具0.1mL刻度）、5mL（具0.1mL刻度）。 4.6量筒：250mL。 4.7 平皿：直径90mm。 4.8 试管：16mm×160mm。 4.9 吸管：10mL（具0.1mL刻度）。 4.10滤纸、漏斗、纱布、棉花、玻璃棒、胶塞。 注：以上试验器材，在试验前应灭菌处理。 4.114 生化培养箱：36℃±1℃。 4.12 恒温水浴箱。 4.13 高压灭菌器。 4.14E 厌氧罐：（厌氧培养箱）。 4.15载玻片。 4.16酒精灯。 4.17电子天平：感量0.1g。 4.18光学显微镜：物镜10×～100×。 4.19 9pH试纸、接种环等。 SB/T 10463——2008 5培养基和试剂 5.1姬姆萨氏染色液（见附录A）。 5.2瑞氏染色按GB/T4789.28—2003中2.6的方法进行。 5.3伊红美蓝染色（见附录A)。 5.4Goodwin氏等复合液体培养基（见附录A）。 5.5Goodwin氏等复合固体培养基（见附录A）。 5.6Hank's液（见附录A)。 检验程序 6 病理组织 病理学检查 分离培养 肉眼检查组 组织触片、 液体培养 固体培养 织病变 姬姆萨氏染色 结果判断 显微镜观察 姬姆萨氏染色 结果判断 显微镜观察 结果判断 图1猪肺炎支原体检验程序 7检验用病料 肺脏、肺门淋巴结。 8检验步骤 8.1病理学检查 8.1.1肉眼检查 肺的病变部位主要见于心叶、尖叶、中间叶及隔叶的前缘。常呈间质性肺炎病变，两侧肺病变大致 对称。病变部界限明显，质地坚实，呈胶样浸润半透明状态。切面湿润、平滑，像嫩肉样（即肉变”）。严 重的病例病变部颜色加深，呈淡紫红色、深紫色或灰白色、灰红色，至后期半透明状态减轻，坚韧度增加， 似胰脏组织（即“胰变”）。 肺门和纵瞩淋巴结肿大，呈灰白色、水肿。切面湿润稍外翻，边缘有时可见轻度充血。 8.1.2触片及染色 检验样品制成触片，自然干燥，用甲醇固定2min～5min，再以pH7.2的磷酸盐缓冲液稀释20倍 的姬姆萨氏染色液染色3h，水洗后立即用丙酮浸染一次，然后镜检。 2 SB/T10463—2008 8.1.3镜检 猪肺炎支原体呈紫红色，多数在细胞外，偶见在嗜中性白细胞的胞浆内。呈球状、环状、椭圆形或两 极形、直杆或弯杆状，单个或群集。 8.2分离培养 8.2.1分离 将病肺组织用Hanks液洗去血液和组织碎片，取病肺25g加人到225mLGoodwin等氏复合液 体培养基中，用均质器8000r/min～10000r/min均质1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎。用灭菌过滤器 过滤，去除杂质。 8.2.2培养 移取10mL滤液转种于100mLGoodwin等氏复合液体培养基中，置厌氧罐（或厌氧培养箱）中 微混浊。 取培养液划线接种于Goodwin等氏固体培养基平板，置厌氧罐（或厌氧培养箱）中37℃士1℃，培 养，在固体培养基上生长缓慢，接种培养7d～10d，观察可见圆形隆起，边缘整齐，表面粗糙，中央有颗 粒的针尖大小或露珠状小菌落。 8.2.3染色 8.2.3.1取液体培养物涂片，白然干燥后火焰固定，姬姆萨氏染色。 8.2.3.2取固体培养物涂片，自然干燥后火焰固定，姬姆萨氏染色。 8.2.4镜检 8.2.5结果判定 镜下所见：因本菌无细胞壁，为多形态微生物，有环状、丝状、点状、杆状和两极状等。液体培养物涂 片，菌体为蓝色、两极浓染的短杆状或返点状，轮廊清晰。固体培养物涂片，菌体为多形性、环状等等，即 可判定为猪肺炎支原体菌体。 SB/T10463-2008 附录A （规范性附录） 试剂和培养基 A.1姬姆萨染色液 A.1.1成分 0.6 g 姬姆萨 甘油 50 mL 塑由 50 mL A.1.2制法 姬姆萨染料0.6g加于甘油50mL中，55℃~60℃水浴加热1.5h~2h后，加甲醇50mL，静置 1d以上，过滤成姬姆萨染色原液，临染色前每毫升中性蒸馏水加原液一滴，即成姬姆萨染色液。 A.2美蓝伊红染色液 A.2.1成分 蒸馏水 75 mL) 混合溶液 美蓝 1 g 蒸馏馅水 75 mL) 混合浴液 高锰酸钾 1.5 g A.2.2制法 美蓝水溶液和高锰酸钾水溶液混合后，55℃～60℃水浴30min，过滤。 A.30.5%伊红酒精液 A.3.1成分 0. 5 g 伊红 无水乙醇 100 mL A.3.2制法 将0.5g伊红置玛瑙乳钵中，边研磨边徐徐加人无水乙醇，使伊红完全溶解于无水乙醇中。 A.4Goodwin等氏复合液体培养基 A.4.1成分 Hartley氏消化汤（a） 300mL 无菌灭活猪血清(b) 200 mL 灭活0.5%水解乳蛋白Hank's液（c) 500mL 灭活酵母浸液(d) 5 mL 20000单位 青霉素 醋酸铊 0.125g/1000mL A.4.2制法 A.4.2.1Hartley氏消化汤 牛心750g用均质器8000r/min~10000r/min均质1min，加蒸馏水1000mL，水浴加热至 80℃时，加人0.8%无水碳酸氢钠1250mL，冷却至45℃加入胰提取液25mL，（新鲜猪胰脏去脂肪切 4 SB/T10463—2008 碎，250g加蒸馏水750mL加无水乙醇250mL置室温中，常加摇动，第三天用滤纸过滤）三氯甲烷 25 mL. 将上述混合物，置于恒温箱中37℃6h或45℃3h，然后加人浓盐酸20mL，水浴蒸汽加热 1h，纱布棉花过滤，以0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.0，趁热以滤纸过滤，再校正pH至7.6，装 瓶121℃15min高压灭菌，备用。 A.4.2.2猪血清配制方法 猪血清水浴56℃30min灭活。 A.4.2.30.5%水解乳蛋白Hank's液配制方法 a）成分 水解乳蛋白 2. 5 g Hank's 液 500 mL 混合上述成分，溶解后115℃10min高压灭菌。 Hank's液配制 1)原液一(1) NaCl 160 g MgSO,·7H20 2 g KC1 8 g MgCl2·6H,0 2 g 按顺序加入到800mL双蒸馏水中。 2） 原液一(2) CaCl22.8g溶于100mL双蒸馏水中。 以上两液混合，加双蒸馏水达1000mL，加2mL三氯甲烷，保存于5℃冰箱中。 3）原液二(1) 3.04 g NazHPO,·12H,O 葡萄糖 20 g KH2PO, 1.20 g 按顺序加入到800mL双蒸馏水中。 4） 原液二(2) 0.4%酚红液100mL(0.4酚红液将0.4g酚红置乳钵中，边研磨边徐徐加入0.1mol/L的氢 氧化钠11.28mL，酚红应完全溶解，置100mL量杯中，最后加蒸馏水达100mL)。 将酚红液与葡萄糖等混合液混合，加双蒸水至1000mL，加人2mL三氯甲烷，保存于5℃ 备用。 5） 按下方配成Hanks(汉克斯氏）液 原液一 1份 原液二 1份 双蒸馏水 18份 混合上述成分，4.08kg10min灭菌，此液在5℃下可保存一个月。用前以1.4%碳酸氢钠 （4.08kg10min灭菌），无菌操作，矫正pH到7.4（根据需要而定），大约每20mL的Hank's（汉克斯 氏）液加0.5mL的碳酸氢钠可达pH到7.4。 A.4.2.4酵母浸液 121℃15min高压灭菌。 A.4.2.5青霉素 20000单位。