SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4090—2015 食源性病原微生物实时PCR检测 通用要求 Real-time polymerase chain reaction(PCR) for the detection of food-borne pathogens—General requirements (ISO 22119:2011,Microbiology of food and animal feeding stuffs- Real-time polymerase chain reaction(PCR) for the detection of food-borne pathogensGeneral requirements and definitions,MOD) 业标准信息服务平台 2015-02-09发布 2015-09-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4090—2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准修改采用ISO22119：2011《食品和动物饲料微生物学 实时PCR法检测食品致病菌的通 用要求和定义》制定，与ISO22119相比，本标准做了如下修改： 对前言进行了修改，删去了引言部分； 一对规范性引用文件的描述按照GB/T1.1的要求进行了修改； 将标准中引用的国际标准用相应的国家标准或行业标准代替，如用SN/T2102.1代替 ISO 22174; 将标准中的3.9、3.10和3.11中的注释部分作为资料性附录分别放在了附录A、附录B和 附录C中。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国河南出人境检验检疫局， 本标准主要起草人：苗丽、李辑、杨娜、钱成、郑皓、张巨洲、张子宏、王艳、王珊、 行业标准信息服务平台 1 SN/T4090—2015 食源性病原微生物实时PCR检测 通用要求 1范围 本标准规定了用聚合酶链式反应（PCR）方法从食品中检测或分离食源性病原微生物的通用要求 也阐述了通过实时PCR扩增和检测核酸序列（DNA及RNA反转录后得到的cDNA）的要求。 本标准中的最低要求是同一实验室的样品具有可重复性，不同实验室间的试验结果具有可比较性 本标准适用于环境样品和动物饲料中食源性病原微生物的检测 注：由于该领域发展迅速，本标准中所举例子是标准起草阶段使用最频繁的案例。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T2102.31 食源性病原体PCR检测技术规范第3部分：定性检测方法样品制备的要求 SN/T 2102.41 食源性病原体PCR检测技术规范第4部分：定性检测方法扩增和检测要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时聚合酶链式反应，即实时PCRReal-timePCR 在酶的参与下，特定的DNA序列通过变性、与特定引物的退火和延伸等一系列步骤完成体外扩增 并实时监测PCR产物的过程。 注1：通常，扩增反应混合物中包含有一个或多个特异性的DNA探针。同时·这些探针结合有一种或多种荧光染 料。运用这种技术，探针与靶核酸序列特异性杂交后，激发出具有一定波长的光，从而产生荧光信号。 注2：对于用SN/T2102.4方法已经确认阳性结果的样品，可用非特异性DNA荧光染料进行检测。 服务平 3.2 PCR产物PCRproduct PCR扩增出的DNA。 3.3 荧光共振能量转移（FRET）fluorescenceresonanceenergytransfer 运用PCR检测食源性病原微生物时，在一定波长电磁辐射的激发下，能量从供体分子向受体分子 转移，从而使受体分子的荧光强度提高。FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关。 3.4 报告基团 reporter 运用PCR检测食源性病原微生物时，在适当波长的电磁辐射的激发下，用于测定杂交过程中特异 性探针的荧光分子。 1 SN/T4090—2015 3.5 运用PCR检测食源性病原微生物时，充当能量受体，从而灭报道基团信号的荧光分子。 3.6 非荧光淬灭基团 dark quencher 发出的能量不在光谱范围内，不能通过PCR仪的光谱检测系统检测到的受体分子。 3.7 有一类酶，如核酸聚合酶，具有将杂交的核酸分子沿5，-3，方向切开的功能。 注：5"-3°-核酸外切酶的活性仅针对双链DNA结构，它取决于酶的种类，可以出现在Taq聚合酶、Tth聚合酶和Tf 聚合酶中。 3.8 荧光探针fluorescentprobe 已知序列的寡核苷酸或类寡核苷酸与一个或多个荧光分子结合。 注：任何能够与靶核酸序列进行特异性杂交，并通过特殊的仪器检测到荧光信号的体系都可以作为荧光探针。 3.9 水解探针hydrolysisprobe 结合两个荧光分子的荧光探针在扩增过程中会被具有5”-3外切酶活性的酶水解成单体。 注：水解探针的原理示意图参见附录A。 3.10 杂交探针hybridizationprobe 注：杂交探针的原理示意图参见附录B。 3.11 分子信标molecularbeacon 荧光探针由三个部分组成：中心部分序列与靶基因序列互补、两端的5端和3端序列互补、报告荧 光基团和淬灭荧光基团分别结合在两端 3.12 检测特定病原体DNA序列的探针probefordetectionofa specificpathogenDNAsequence 探针序列与病原体DNA序列互补，携带一个报告荧光基团，能发出一定波长的信号，该信号能够 被光学检测系统检测到。 3.13 用于检测内部控制核酸序列的探针probefordetection of aninternal control nucleicacid sequence 探针携带有一个能够确认扩增情况的报告基团。 注2：该应用要求所使用的仪器能够检测不同波长的信号 3.14 参比荧光 passivereference 反应混合物中的用于校正信号的荧光分子。 注：这些分子可以与核酸序列或其他分子结合而不参与反应， 3.15 荧光检测水平的基线baselinefluorescencedetectionlevel 反应达到高于背景值的荧光强度。 2