SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3985—2014 水生动物链球菌感染检疫技术规范 Quarantine protocol for infection with streptococcus in aquatic animals 行业标准信息服务平台 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3985—2014 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国宁波出人境检验检疫 局、福建医科大学附属第一医院 本标准主要起草人：王武军、白泉阳、张吉红、高丽钦、郑腾、张体银、于师宇、张志灯、林素洁。 行业标准信息服务平台 1 SN/T3985—2014 水生动物链球菌感染检疫技术规范 1范围 本标准规定了鱼类链球菌的临床诊断、病原分离、生化鉴定和聚合酶链式反应的检测方法。 本标准适用于鱼类链球菌感染的临床诊断、病原鉴定与检疫。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 3概述 鱼类链球菌感染简介参见附录A。 4临床诊断 4.1 临床症状 病鱼呈急性嗜神经组织病症，行为异常，如螺旋状或旋转式游泳，在水面作头向上或者尾向上的转 圈游动。身体呈C形或逗号样弯曲。眼眶周围和眼球内出血，眼球浑浊，眼球突出。鳃盖内侧发红、充 血或强烈出血。病鱼腹部体表具点状或斑块出血或溃疡。肛门发红。但在高温季节，病鱼呈急性感染 时，有可能未表现临床症状时病鱼已死亡。可根据眼球突出、鳃盖内侧出血和异常神经性运动等典型症 状作初步诊断。 4.2病理变化 病鱼心外膜肥厚。腹腔明显出血，肝脏和腹腔脂肪出血。肝脏、胆囊、脾脏肿大、出血，严重时糜烂 肠炎，肠道内有积水或黄色粘液，肛门突出。 5实验室诊断 5.1设备、材料和试剂 5.1.1主要设备 5.1.1.1 天平：读数精度0.1g。 1 SN/T 3985—2014 5.1.1.2 冰箱。 5.1.1.3 培养箱。 5.1.1.4 恒温水浴锅。 5.1.1.5 生物显微镜。 5.1.1.6 Ⅱ级生物安全柜。 5.1.1.7 红外加热器。 5.1.1.8 台式冷冻高速离心机。 5.1.1.9 PCR仪。 5.1.1.10 电泳仪。 5.1.1.11 凝胶成像仪。 5.1.1.12 灭菌试管。 5.1.1.13 灭菌吸管。 5.1.1.14 单道可调微量移液器（2μL～20μ，20μL～200μL，100μL~1000μL）及其配套吸头。 5.1.2 材料和试剂 5.1.2.1 水：符合GB/T6682中三级水的规格要求。 5.1.2.2 除另有规定，所用试剂均为分析纯。 5.1.2.3 普通琼脂绵羊血平板培养基、脑心浸液(BHI)培养基及其琼脂培养基的制备方法见附录B。 5.1.2.4 革兰染色液。 5.1.2.5 过氧化氢酶试剂。 5.1.2.6 细菌生化鉴定管或商品化生化鉴定试剂盒。 5.1.2.7 细菌基因组DNA提取试剂盒。 5.1.2.8 商品化DNA扩增试剂盒：一20℃保存，不要反复冻融。 5.1.2.9 扩增海豚链球菌16SrRNA的297bp片断的引物序列如下 Sin-F:5'-CTAGAGTACACATGTACTTAAG-3" Sin-R:5′-GGATTTTCCACTCCCATTAC-3' 5.1.2.10 扩增无乳链球菌CAMP因子cfb基因的468bp片断的引物序列如下： Sag-F:5’-AAGCGTGTATTCCAGATTTCCT-3' Sag-R:5'-CAGTAATCAAGCCCAGCAA-3 5.1.2.11 其他试剂：无水乙醇、琼脂糖（电泳纯）、分子量标准（100bp～1000bp）。 5.1.2.12 电泳缓冲液、电泳加样缓冲液、溴化乙锭（EB)染色液，配制方法见附录B。 商品化DNA纯化回收试剂盒。 5.1.2.13 5.1.2.14 海豚链球菌、无乳链球菌标准菌株，由相关菌种保藏机构提供。 5.2 2样品采集 对病鱼，急性病例可无菌采集肝、头肾、脾脏等组织，慢性病例可无菌采集脑、头肾、肝、脾脏、眼等组 织，以采集病鱼的脑和头肾为佳。采样数量、包装和运输参照GB/T18088和SC/T7103。 5.3细菌分离、培养和鉴定 5.3.1细菌分离、培养和初步鉴定 5.3.1.1送检病料的细菌分离和组织触片检查 凡是涉及生物安全的操作和处理均应符合GB19489的相关规定。用经红外加热器灭菌并冷却的 接种环蘸取病料内部组织后划线接种于普通琼脂绵羊血平板（见B.1），于29℃培养24h，如菌落生长 2