SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3960—2014 蓝莓矮化植原体检疫鉴定方法 Detection and identification of Blueberry stunt phytoplasma 行业标准信息服务平台 2014-04-09发布 2014-11-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3960—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：李鑫、林长军、王有福、姜一、曹冬梅、胡强、刘卉秋、王秀芬、徐凤敏、牟海青。 行业标准信息服务平台 SN/T3960—2014 蓝莓矮化植原体检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了蓝莓矮化植原体的检疫和鉴定方法。 本标准适用于进出境蓝莓树苗木及蓝莓产品中蓝莓矮化植原体的检疫和鉴定。 2蓝莓矮化植原体基本信息 英文名：Blueberrystuntphytoplasma 分类地位：软壁菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollicutes），非固醇菌原体目（Acholeplasmatales）， 非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae），植原体属（Phytoplasma），16SrI植原体组D亚组。 蓝莓矮化植原体的其他信息参见附录A。 3方法原理 蓝莓矮化植原体生物学特性和基因特性作为本标准鉴定方法的主要依据。 DAPI染色后的形态学观察为初步筛查方法；以植原体核糖体16SrDNA通用引物进行PCR扩增、 测序及限制性内切酶指纹图谱为主要的判定依据。 仪器用具和主要试剂 41 行V 4.1仪器 PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、台式冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰 箱、涡旋振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、荧光显微镜、透射电子显微镜、超薄切片机等。 信息服务平台 4.2用具 移液器、研钵、离心管、PCR管、量筒、烧杯、酒精灯、镊子等、 4.3主要试剂 4.3.1 CTAB缓冲液 CTAB 20 g/L Tris-HCl 100 mmol/L(pH 8.0) EDTA 20 mmol/L(pH 8.0) NaCl 1.4 mol/L PVP-40 10 g/L 4.3.2 2PBS缓冲液（0.2mol/LpH7.4） 无水NaH,PO4 24 g 1 SN/T3960—2014 NaOH 4.9 g 加水定容至1000mL。 4.3.3其他试剂 DAPI、巴比妥钠、乙酸钠、2%钱酸水溶液、戊二醛、0.1 mol/L盐酸苯酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙 5检测鉴定方法 5.1症状观察 5.1.1现场查验 检测。 5.1.2DAPI染色 选取幼嫩组织（新叶叶梗、枝梢、茎秆及根部韧皮部组织），切片，用1μg/mLDAPI溶液（4"，6-二 基-2-苯基吲哚）染色，在460nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的监色荧光信号 表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均，故每个样品应选取不同部位的幼嫩材料进行检测。 5.1.3透射电镜观察 将采集的样品制备超薄切片，通过电子显微镜观察植物韧皮部是否存在植原体粒体。具体方法见 附录B。 5.2DNA提取 处理样品的方法主要为植物组织中植原体基因组DNA提取方法。 取0.1g样品置于预冷的研钵中，在液氮中将样品研磨成粉末状，并迅速转入1.5mL的离心管中。 加人800uL65℃预热的CTAB提取缓冲液，涡旋振荡充分混匀，65℃水浴50min，每隔10min轻轻 颠倒混匀一次。冷却至室温，加人等体积的的三氯甲烷：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，静置10min， 4℃10000r/min离心10min，取上清液，重复一次。加入等体积异丙醇或2倍体积预冷的无水乙醇， 上清液，离心管倒置滤纸上干燥，用800uL70%冰乙醇清洗沉淀两次，以除去盐离子等。加入800uL 70%冰乙醇后，轻轻颠倒离心管几次，将沉淀于底部的DNA弹起，放置离心管10min.4℃10000r/min 离心1min，弃上清液，重复一次，风干去除乙醇。可重复上述步骤一次。最后在沉淀中加入200μLTE溶 解DNA沉淀，一20℃保存备用。 植原体基因组DNA提取方法也可采用商品化试剂盒提取。 5.3通用引物PCR扩增及序列测定 用2对引物进行巢式PCR反应及凝胶电泳检测，扩增植原体16SrDNA序列，方法见附录C。 5.4序列分析鉴定 将第二轮PCR产物（引物P1A/16S-SR，产物大小为1525bp）进行序列测定，在Genebank中进行 序列比对。 2