ICS 65.020.20 LY B 65 中华人民共和国林业行业标准 LY/T23472014 刚竹属DNA扩增片段长度多态性（AFLP） 分析方法 Method of DNA amplification fragment length polymorphism (AFLP) forPhyllostachysbamboo 2014-12-01实施 2014-08-21发布 国家林业局 发布 . LY/T2347—2014 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准的附录为规范性附录。 本标准由全国竹藤标准化技术委员会（SAC/TC263）提出并归口。 本标准起草单位：国际竹藤中心、北京林业大学、中国林业科学研究院亚热带林业研究所。 本标准主要起草人：李雪平、高志民、牟少华、陈敏、袁金玲。 . I LY/T2347—2014 刚竹属DNA扩增片段长度多态性（AFLP） 分析方法 1范围 本标准规定了刚竹属（Phyllostachys）竹种的DNA提取、酶切、连接、扩增实验步骤及采用的仪器 设备。 本标准适用于刚竹属竹种DNA多态性的分析。 2试剂 2.1所用化学试剂如没有特殊说明，均为分析纯。 2.2DNA提取液：1mol/LTris-HClpH8.2、细胞裂解液（1mol/LTris-HClpH7.5，0.25mol/LED TApH8.0,5mol/L氯化钠，2%CTAB)与5%SLS按5：5：2混合，在使用前加人亚硫酸钠至终浓 度为0.02mol/L。 2.3三氯甲烷：异戊醇=24：1。 2.4异丙醇。 2.570%乙醇：70mL无水乙醇加蒸馏水定容到100mL。 2.65mol/L氯化钠：称取29.22g氯化钠，用蒸馏水溶解后定容到100mL。 2.7 0.5mg/mL溴化乙锭：称取5mg溴化乙锭，用蒸馏水溶解后定容到10mL。 蓝0.125g。 2.910×TBE：Tris108.0g，硼酸55.0g0.5mol/LEDTA(pH8.0)40mL，定容到1000mL。 2.10 040%丙烯酰胺溶液：2.0g甲叉双丙烯酰胺，38.0g丙烯酰胺混合加水定容到100mL。 2.1110%过硫酸胺溶液：1.0g过硫酸胺加水定容到10mL。 . 3仪器 3.1PCR仪（具有touchdown功能，温度精度士0.2℃）。 3.2移液器。 3.34℃低温离心机（max14000r/min以上）。 3.4水浴锅。 3.5电泳仪（可满足DNA测序）。 3.6紫外分光光度计。 3.7 分析天平。 3.8 摇床。 试验步骤 4.1DNA提取 按照附录A的方法提取和检测竹子基因组DNA。电泳检测DNA主带完整、平均分子量>20kb； 1 LY/T2347—2014 纯度为1.8<OD26/ODz80<2.0。 4.2酶切反应 对所选样品采用EcoRI/MseI双酶切： 板DNA200ng；加超纯水至20μL。 酶切反应条件为37℃，3h；反应结束后65℃10min使内切酶失活。 4.3 3连接反应 接头序列参照附录B。 反应体系（20μL)为：10×T4缓冲液2μL；EcoR1接头（50μmol/L)1μL；MseI接头（50μmol/L） 1μL；T4DNA连接酶（5U/μL)0.4μL；酶切产物10μL；加超纯水至20μL。 连接反应条件为：4℃过夜。 4.4预扩增反应 预扩增引物参照附录B。 反应体系为：10×缓冲液2μL;dNTPs(10mmol/L)0.4μL；Taq酶（5U/μL)0.2μL，预扩增引物 Eo（20μmol/L)0.5μL；预扩增引物Mo（20μmol/L)0.5μL；连接模板2μL；加超纯水至20μL。 PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s；50℃复性45s，72℃延伸1min，26个循环。 4.5选择性扩增反应 选择性扩增引物参照附录B。 反应体系为：10×缓冲液2μLdNTPs(10mmol/L)0.4μL；Taq酶（5U/μL）0.2μL；选择性扩增 引物Eprimer(20μmol/L)1μL；选择性扩增引物Mprimer（20μmol/L)1μL模板DNA2μL(预扩增产物稀 释20倍）；加超纯水至20μL。 PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性35s，65℃复性35s（每循环降低0.7℃），72℃延 伸1min，12个循环；94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，23个循环。 4.6变性 将20μL变性缓冲液加人PCR反应产物，95℃变性5min。 4.7制胶和电泳 按附录C进行。 4.8染色· 按附录D进行。 4.9数据统计 选取电泳平板上清晰可辨的电泳条带，在相同片段位置上，以“1”和“0”分别记录条带的有无，制 作1/0矩阵。 2 LY/T2347—2014 附录A (规范性附录） DNA的提取及检测 A.1DNA提取 A.1.1取0.1g幼嫩叶片，于液氮中迅速研磨成粉末，快速移至1.5mL离心管中，置于冰上。 2次。 A,1.3 A.1.4 吸取430μL上清液至1.5mL离心管中，用三氯甲烷/异戊醇重复抽提1次。 A,1.5 吸取350μL上清液至1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，于一20℃放置 30 min。 A.1.612000r/min离心10min，弃上清液。 A.1.7 加入1mL70%乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心5min，弃上清液，在超净工作台内风干。 A.1.8 加入200μL超纯水溶解DNA。 A,1.9 加人200μL5mol/L氯化钠，混匀后加人2倍体积的无水乙醇，沉淀20min。 A.1.10 13000r/min离心10min，弃上清液。 A.1.11 加人1mL70%乙醇洗涤沉淀，13000r/min离心5min，弃上清液，在超净工作台内风干。 A,1.12 用40μL超纯水溶解DNA，存于一20℃备用。 A.2 DNA质量及浓度检测 A.2.1 在紫外分光光度计上读取OD2s和OD280，计算OD260/OD280。 A.2.2 根据下面公式计算DNA浓度。 DNA浓度（μg/mL)=50×OD26o的读数X×稀释倍数 A.2.3 3用1%琼脂糖电泳检测DNA分子量大小。 3