DB61/T2134—2025 I目  次 前言.................................................................................II 1范围...............................................................................1 2规范性引用文件.....................................................................1 3术语和定义.........................................................................1 4样品采集...........................................................................1 5LAMP技术检测.......................................................................2 6防治技术...........................................................................2 7档案记录...........................................................................2 8证实方法...........................................................................2 附录A（资料性附录）苹果褐斑病相关资料...............................................3 附录B（资料性附录）LAMP检测技术和推荐药剂及使用方法................................4DB61/T2134—2025 II前  言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由陕西省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：西北农林科技大学、陕西省植物保护工作总站、乾县果业服务中心、米脂县植保 植检站。 本文件主要起草人：徐亮胜、黄丽丽、冯浩、王亚红、吴晓政，巩玉峰。 本文件由西北农林科技大学负责解释。 本文件首次发布。 联系信息如下： 单位：西北农林科技大学 电话：029—87091312 地址：陕西省杨凌区邰成路西北农林科技大学 邮编：712100DB61/T2134—2025 1苹果褐斑病早期监测技术规范 1范围 本文件规定了苹果褐斑病的样品采集、LAMP技术检测、结果判定、防治技术、档案记录等技术要 求，描述了对应证实方法。 本文件适用于环介导等温扩增分子检测技术。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T8321农药合理使用准则 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 环介导等温扩增技术loop-mediatedisothermalamplification，LAMP 一种在特定恒温条件下，实现短时间内对靶标序列高效扩增的技术。检测结果通过肉眼观察绿色荧 光的生成进行判断。 3.2 苹果褐斑病 又称绿缘褐斑病，由苹果双壳菌侵染所引起的真菌病害，造成生长季大量落叶，树势衰弱，影响苹 果产量。 3.3 带菌率 也称田间样品带菌检出率，指利用苹果褐斑病LAMP技术检出的阳性结果数占总样品数的百分率。 4样品采集 4.1时间 开花后至套袋前，每隔10d采集一次样品。 4.2方法DB61/T2134—2025 2采取五点取样法，每点1株，在东、西、南、北四个方位各固定1个枝条，每枝条采1张叶片，用吸 水纸包好，保存于4℃冰箱备用。 4.3处理 样品用0.6%次氯酸钠表面消毒5min后，无菌水清洗3次，用无菌手术刀切取5g组织，装进无菌2mL 离心管中提取DNA进行LAMP检测。 5LAMP技术检测 5.1操作方法 见附录B。 5.2结果判定 待检样品加入反应试剂50min后，液体呈绿色，判定为样品带菌。 6防治技术 6.1防治要求 气象条件适宜于褐斑病发生时，以LAMP技术检测的田间叶片带菌率为依据，确定化学防控时期和 药剂种类。农药使用按照GB/T8321（所有部分）和NY/T1276规定执行。药剂种类选择见附录B。 6.2防治方法 6.2.1当检测带菌率小于5%时，不需要采取化学药剂防治。 6.2.2当检测带菌率为5%~20%时，全园使用2次保护性杀菌剂，每次喷药时间间隔10d~15d。 6.2.3当检测带菌率为21%~30%时，全园使用1次~2次内吸性治疗剂，每次喷药时间间隔15d。 6.2.4当检测带菌率大于30%时，增加防治次数，缩短喷药间隔时间。 7档案记录 7.1样品记录包括样品来源、种类（品种）、时间、检测时间、地点、方法和结果等； 7.2防治效果记录包括果园地点、品种、树龄、喷施药剂名称、喷施药剂前的病情指数、喷施药剂后 的病情指数、防治效果。 7.3记录要有检测人员、审核人员签字，档案妥善保存。 8证实方法 采用实验室对照验证的方法对5的条款进行证实。采用实验室检测与田间试验相结合对6进行证实。 通过检查LAMP数据、对照气象记录、检查农药使用情况的方法对6.1的条款进行证实。采用核查用药记 录和实验室研究相结合的方法对6.2的条款进行证实。DB61/T2134—2025 3AA 附录A （资料性） 苹果褐斑病相关资料 A.1病原 为子囊菌门苹果双壳菌DiplocarponmaliY.Harada&K.Sawamura。 A.2发病特征 A.2.1叶片发病特征 一般树冠下部和内膛叶片先发病，常见的有针芒型、同心轮纹型、混合型和褐点型4种症状。 A.2.2果实发病症状 先出现淡褐色小斑点，逐渐扩大为圆形、褐色、凹陷、表面有黑色小粒点，病部果肉褐色，海绵状 干腐。 A.3发病规律 病菌主要以菌丝体在病落叶中越冬，翌年春季产生分生孢子和子囊孢子随风雨传播，直接入侵造成 初侵染，条件适宜时存在多次再侵染。冬季温暖潮湿，春雨早、雨量大，夏季阴雨连绵，发病早且重。 树冠内膛密闭部位叶片以及树冠下部叶片发病早且重。DB61/T2134—2025 4BB 附录B （资料性） LAMP检测技术和推荐药剂及使用方法 B.1LAMP检测技术 B.1.1扩增模板 以提取的苹果叶片样品DNA为模板，以苹果褐斑菌株105基因组DNA为阳性模板，以无菌水为阴性 模板，采用特异性引物对待测样品进行LAMP检测，引物见表B.1，表B.1给出了苹果树褐斑病LAMP检 测引物。 表B.1苹果树褐斑病LAMP检测引物序列 引物类型 引物序列 上游外引物（F3） GTAGTAGCCATCCTCGCGTCTGTGGAAGTGGGGGGGGTT 下游外引物（B3） GCGGCACCGCCACTGATTGCCCTGGCTTGGTCTTGG 上游内引物（FIP） TGATCCGAGGTCACCGG 下游内引物（BIP） CCGAGCGTCATTGACAACC B.1.2扩增体系 扩增反应在25μL体系中进行，反应体系见表B.2，表B.2给出了苹果褐斑病的LAMP检测体系。 表B.2苹果褐斑病LAMP反应体系（25μL） 组分 工作液浓度 加样量/μL 10×IsothermalAmplificationBuffer 10× 2.5 dNTPs 10mM 3.5 MgSO4 100mM 1 betaine（甜菜碱） 10M 0.5 上游外引物（F3） 10μmol/L 1.6 下游外引物（B3） 10μmol/L 1.6 上游内引物（FIP） 10μmol/L 0.5 下游内引物（BIP） 10μmol/L 0.5 BstDNApolymerase 8U/μL/ 1 无菌水 / 6.5 模板 / 1 B.1.3扩增条件