ICS65.150 CCSB50 21 辽宁省地方标准 DB21/T4330—2025 夏洛来羊体外胚胎生产及手术法胚胎移植 技术规范 Technicalspecificationforinvitroembryoproductionandsurgical embryotransferofCharlottesheep 2025-11-30发布 2025-12-30实施 辽宁省市场监督管理局  发布DB21/T4330—2025 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：锦州医科大学、朝阳市朝牧种畜场有限公司、辽宁省农业发展服务中心。 本文件主要起草人：王春强、张贺春、韩迪、张喆、马巍、李纯锦、张楚依、田俊英、王恩辉、李 宁、杨友成。 本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862。 起草单位通讯地址：锦州医科大学（辽宁省锦州市凌河区松坡路三段40号），联系电话：（0416） 3675111，3675222。DB21/T4330—2025 1夏洛来羊体外胚胎生产及手术法胚胎移植技术规范 1范围 本文件规定了夏洛来羊供体羊选择与饲养管理、供体羊激素处理、卵母细胞采集、卵母细胞体外成 熟及鉴定、体外受精、胚胎体外培养及鉴定、胚胎冷冻保存及解冻、受体羊选择及饲养管理、手术法胚 胎移植和妊娠诊断的体外胚胎生产及手术法胚胎移植主要环节的技术要求。 本文件适用于夏洛来羊体外胚胎生产及移植。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期的对应版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T5458液氮生物容器 NY/T1571羊胚胎移植技术规程 NY/T1900畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 体外胚胎生产invitroembryoproduction 指对供体母羊进行激素处理和活体采集卵母细胞，或从屠宰场摘取卵巢后采集卵母细胞，在体外条 件下对卵母细胞进行成熟培养、体外受精、胚胎培养，生产可用于胚胎移植的胚胎的过程。 3.2 羊胚胎移植技术ovineembryotransfertechnology 通过手术法收集的良种母羊体内早期胚胎，或通过体外受精及其他方式获得的体外早期胚胎，移植 到相同生理状态的同种受体母羊体内，使之继续发育成新个体的生物技术。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CIDR：孕激素阴道栓（ControlledInternalDrugReleasingdevice） FSH：促卵泡生成素（follicle-stimulatinghormone） PG：前列腺素（Prostaglandin) COCs：卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus-oocytecomplex) PMSG：孕马血清促性腺激素（PregnantMareSerumGonadotropin） IVM：卵母细胞体外成熟培养液(InVitroMaturation)DB21/T4330—2025 2IVF：体外受精液(InVitroFertilization) IVC：体外培养液(InVitroCulture) 5供体羊与受体羊的选择与饲养管理 5.1选择条件 按照NY/T1571对供体羊和受体羊进行选择。 5.2饲养管理 按照NY/T1571对供体羊和受体羊进行饲养管理。 6供体羊激素处理 6.1药品 所需药品按NY/T1571执行。 6.2激素处理方式 在发情周期的任意一天早6：00放CIDR，记为第0d；第7d更换CIDR。第12d～14d，采用逐渐递 减法连续3d肌注FSH，每天早6：00和晚18：00各1次。3d注射总量为360mg，第1d每次注射80mg，第 2d每次注射60mg、第3d每次注射40mg。在第一次注射FSH的同时肌注PG2mL，在第6次注射FSH的同 时取出CIDR。 7卵母细胞采集 7.1活体采卵 供体羊的保定、麻醉、消毒、手术过程按NY/T1571执行。供体羊腹腔打开后，食指和中指从刀口 进入，在骨盆腔、耻骨前沿触摸子宫角，并将子宫、卵巢引出刀口外。用吸有抽卵液（配制方式详见附 录A）的10mL注射器抽取突出卵巢表面的卵泡，边缘用纱布止血。将卵泡液体置于60mm平皿内，在体 视镜下捡出所有卵母细胞。 卵丘细胞2层以上，胞质均匀为合格的COCs。手术后供体的子宫角需喷涂普鲁卡因青霉素凝胶，大 腿部需注射土霉素进行消炎处理，同时肌肉注射4mg～6mg的PGF2α，消除卵巢上黄体。 7.2离体采卵 取屠宰1h内的羊卵巢，放入含100IU/mL青链霉素双抗的37℃生理盐水中，运回实验室。用剪 刀将卵巢周围的结缔组织去除干净，38.5℃生理盐水清洗卵巢3次，并浸泡于生理盐水中。用吸水纸 吸附卵巢上的生理盐水，再用吸有抽卵液的注射器抽吸突出卵巢表面的卵泡，将卵泡液体置于60mm 平皿内，在体视镜下捡出所有卵母细胞。 8卵母细胞体外成熟及成熟鉴定DB21/T4330—2025 3将捡出的卵母细胞用抽卵液洗涤3次，再用IVM液（配制方式详见附录A）洗涤3次，按50枚/孔～80 枚/孔的密度，放入0.6mL/孔IVM液并覆盖0.3mL矿物油的四孔板内。38.5℃、5%CO2、饱和湿度的37℃ 二氧化碳培养箱中培养24h。卵母细胞成熟标准为：第一极体形态正常、胞质均匀、颗粒均匀、卵周隙 内无杂质以及透明带形态正常。 9体外受精 9.1鲜精体外受精 9.1.1对种公羊的选择 按照NY/T1571对种公羊进行选择。 9.1.2采精 采精前对种公羊外生殖器清洗消毒。采集的精液外观及气味正常，精子活力大于0.7，畸形率小于 15%，可进行后续操作。精液用稀释液按1:1稀释，放入含有30℃温水的250mL烧杯中，置于4℃冰箱 中平衡1.5h，待用。 9.1.3鲜精上浮 取0.2mL平衡好的鲜精加入装有2mLIVF液（输卵管缓冲液SOF）的圆底试管底部，将试管倾斜45°， 置于二氧化碳培养箱内，待精子上浮30min后，取上层约1mL液体于1.5mL离心管内，用1500r/min转 速离心4min两次，弃去上清，留约0.1mL，轻轻混匀，制成精子混悬液，备用。 9.1.4体外受精 用含量0.1%的透明质酸酶对成熟后的卵母细胞进行处理，除去部分卵丘细胞，并用IVF液洗涤3 次后置于装有0.5mLIVF液的四孔培养皿内。取30μL精子混悬液至四孔培养皿内，与卵母细胞共同 孵育。将精子和卵母细胞共同孵育18h～24h的受精卵用IVC液洗涤3次，去除粘附于卵母细胞表面 的精子。 9.2冻精体外受精 从符合GB/T5458的液氮中迅速取出冻精细管，投入37℃水浴锅解冻15s～20s，取出细管并用 纱布擦拭，剪掉细管的两端，将精液推入1.5mL的离心管内，用移液枪将精液移入含1mLIVF液的试 管底部，上浮30min后，按照操作步骤9.1.3和9.1.4进行体外受精。 10胚胎体外培养及鉴定 10.1胚胎体外培养 将受精卵置于IVC四孔培养皿中培养至48h，显微镜下统计卵裂率，按照NY/T1571对胚胎进行 等级鉴定，其中1、2级胚胎可用于胚胎移植,发育至囊胚的胚胎可用于胚胎冷冻。早期胚胎发育模式图 见附录B。 10.2胚胎质量鉴定DB21/T4330—2025 4采集的胚胎用事先在培养箱预热的平皿接收，写好编号，置于26℃的恒温板上。用实体显微镜在 平皿中分检可用的胚胎放入含有胚胎保持液的平皿中，盖好平皿盖后待处理。早期胚胎发育模式图见附 录B。按照NY/T1571对胚胎进行等级鉴定，其中1、2级胚胎可用于胚胎移植或冷冻保存。 11胚胎冷冻保存与解冻 11.1胚胎的冷冻保存 按照NY/T1900对胚胎进行冷冻保存。 11.2冷冻胚胎的解冻 从液氮中取出装有胚胎的细管，空气中停留10s～15s后投入35℃水浴锅中，轻轻晃动细管约 15s，待细管中有气泡产生，剪去细管塞，将胚胎移入0.2mol/L～0.5mol/L蔗糖磷酸盐缓冲液中3min～ 5min，将胚胎移至保存液中洗涤3次～4次后对胚胎进行鉴定，2级以上胚胎可进行移植。 12手术法胚胎移植 12.1受体羊同期发情处理 在发情周期的任意一天早8:00放入CIDR，同时注射PGF2α2mL，记为第0d，第6d早8:00去栓 的同时肌注300IUPMSG，此后三天观察发情。 12.2受体羊胚胎移植 受体母羊移植部位的消毒方法与采卵时的消毒方法相同。用腹腔镜观察受体母羊卵巢上的黄体情况， 对有1cm～2cm且圆润饱满黄体的受体进行手术法子宫角移植。可移植1枚1级胚胎，或2枚2级胚 胎。消炎处理按7.1执行。 12.3胚胎发育期与受体移植时间的对应关系 胚胎发育期与受体移植时间的对应关系见附录C，移植时机应根据受体时间选择对应时期胚胎进行 移植。 13妊娠诊断 连续观察2个～3个情期后受体无发情表现再用B超检测，或直接在45d～60d通过B超的方法 检查一次，结合母羊表现可判定是否受孕。