ICS 65.120 CCS B 46 21 辽宁省 地方标准 DB21/T 4329—2025 饲用沼泽红假单胞菌生产技术规程 Technical regulation for production of photosynthetic bacteria （Rhodopseudom onas palustris ） 2025 - 11 - 30发布 2025 - 12 - 30实施 辽宁省市场监督管理局 发布 DB21/T 4329 —2025 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则第 1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：大连海洋大学、辽宁省农业农村发展服务中心、大连金砣水产食品有限公司、朝 阳广硕牧业有限公司、朝阳市检验检测中心。 本文件主要起草人：王连顺、杨国军、张洪艳、李思源、刘洋、衣启麟、刘奇、汲全柱、刘子扬、 潘相彤、郑凯、林颖、黄家强、郑云霞、张莹莹、李爽、陈守清。 本文件发布实施后， 任何单位和个人如有问题和意见建议， 均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：沈阳市和平区太原北街 2号，联系电话： 024-23447862 。 文件起草单位通讯地址：辽宁省大连市沙河口区黑石礁街 52号，联系电话： 0411 -84762887 。 DB21/T 4329—2025 1 饲用沼泽红假单胞菌生产技术规程 1 范围 本文件规定了饲用沼泽红假单胞菌的生产环境、设备要求、生产技术流程和生产记录的技术内容。 本文件适用于饲用沼泽红假单胞菌的生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 191-2008 包装储运图示标志 GB 3095-2012 环境空气质量标准 GB 5749-2022 生活饮用水卫生标准 GB/T 10648 -2013 饲料标签 GB 20287 -2006 农用微生物菌剂 GB/T 23181 -2008 微生物饲料添加剂通用要求 GB/T 38579 -2020 生物产品中光合细菌的测定 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 沼泽红假单胞菌 Rhodop seudomonas palustris 沼泽红假单胞菌是一种非产氧光合细菌，隶属于紫色非硫细菌 (purple non -sulfur bacteria, PNSB)，红螺菌科 (Rhodospirillaceae) 、红螺菌属 (Rhodospirillum) ，菌体短杆状或球状，革兰氏阴性 菌，营光能自养 或光能异养 ，可在光厌氧、光微好氧、光好氧、 暗好氧、暗厌氧 多种环境中生长。 4 生产环境和设备要求 4.1 生产环境 4.1.1厂区空气质量应符合大气环境质量标准 GB 3095-2012 4.2 中Ⅱ类要求。 4.1.2发酵用水应符合 GB 5749-2022规定。 4.1.3生产车间配备消毒灭菌设施，原菌种储藏室和无菌操作间与生产车间分开。 4.2 生产设施设备 4.2.1菌种储藏室，菌种培养室和生产车间。 4.2.2冰箱（4 ℃）、冰柜（ -40 ℃）、恒温光照培养箱、 pH计、电子天平（精度 0.01 g）、分光光 度计，光学显微镜（ 1000×）、照度计（精度 0.1 ）、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅和不锈钢发酵罐 （容量 200 L-2000 L、承压 0.3 MPa）。 DB21/T 4329 —2025 2 5 生产技术流程 5.1 生产流程 饲用沼泽红假单胞菌的生产按照规定的生产流程（附录 A）进行。 5.2 原菌种质量 5.2.1原菌种为沼泽红假单胞菌（ Rhodop seudomonas palustris ），来源于国家级菌种资源库（ CICC 或CGMCC等）或经过国家级科研单位的鉴定，并有菌种鉴定报告，且有完整的菌种来源信息。 5.2.2原菌种鉴定报告或原菌种来源信息应包括菌种属及种的学名、形态、生理生化特性及鉴定依据、 活性。 5.3 培养基配置 5.3.1培养基配方为乙酸钠 3.0 g，丙酸钠 0.3 g，磷酸二氢钾 0.5 g，磷酸氢二钾 0.3 g，硫酸镁 （MgSO4·7H2O）0.2 g，硫酸铵 0.3 g，氯化钙（ CaCl2·2H2O）0.05 g，氯化钠 0.1 g，酵母膏 3.0 g， 水1000 mL。 5.3.2培养基配置方法为准确称取培养基各种成分后，置于烧杯中加入少量水溶化，定容至 1000 mL， 采用3moL/L盐酸和氢氧化钠调节 pH 值，使灭菌后的 pH值为6.8±0.1，封口， 121 ℃灭菌 20 min。 5.4 灭菌 发酵罐的装液量为容积的 60 %， 液体培养基、 发酵罐、 补料罐等采用高压蒸汽灭菌， 灭菌条件 121 ℃， 0.1 MPa，20 min。 5.5 液体菌种培养 5.5.1培养容器 液体菌种培养容器为可高压蒸汽灭菌的 200 ｍＬ～500 ｍＬ透明玻璃瓶。 5.5.2培养条件 从培养基接种原菌种到液体培养基中，光照 强度4,000 lx ～5,000 lx ，培养温度为（ 30±2）℃， 静置培养 3ｄ～5ｄ。 5.6 液体菌种检测 平板涂布法测定菌数及杂菌率，按照 GB/T 38579 -2020中8.3操作要求进行检测，菌数≥ 1×109 CFU/mL，杂菌率＜ 0.1 ‰，为合格菌种。 5.7 接种 5.7.1用于制备二级菌种的接种量为 5%。二级菌种到发酵罐的接种量为 10%。 5.7.2接种时需要无菌操作，调节进、排气阀（通入的气体为氮气或其它惰性气体） ，使接种口有气体 排出。 5.8 规模发酵 5.8.1容器 不锈钢发酵罐的体积根据生产规模自定，发酵容积 在200 L～2000 L，承压0.3 MPa。 DB21/T 4329 —2025 3 5.8.2接种量 按发酵体积的 10 ％接种液体菌种。 5.8.3温度 发酵温度为 30±2 ℃。 5.8.4发酵方式 规模发酵应密闭、厌氧，发酵过程中不通气，或通入氮气，搅拌转数 50 r/min～100 r/min 。当有 效活菌数达到每毫升 1010级，结束发酵。 5.8.5发酵周期 最适宜发酵条件下发酵 7 d～10 d。 5.8.6生长监测 采用血球计数板法或光密度法每天测定菌体密度。 5.9 污染控制 定期检查细菌的生长状况，保持发酵容器内的卫生，如发现有藻类或其它杂菌污染，应终止培养， 清洗消毒，重新接种。 5.10 发酵后处理 5.10.1质量检测 对发酵产品按批次进行抽样检测，其技术指标应符合 GB 20287 -2006中5.3条表1和表3的规定， 试验方法按 GB 20287 -2006第6章有关规定执行，成品形态应为淡黄色均匀一致的浓稠液体。 5.10.2包装贮存 5.10.2.1 对检验合格的发酵产品，可通过灭菌处理的包装容器灌装、密封包装液体菌体。液体菌体经 过膜过滤、菌泥添加载体和保护剂后，烘干制备固体菌体（粉剂 或颗粒）产品。 5.10.2.2 采用白色聚乙烯有密封盖的塑料桶或塑料瓶，外包装应有鲜明的标签，标签应符合 GB/T 10648-2013规定。外包装标识应符合 GB 191-2008规定。 5.10.2.3 产品贮存于避免阳光直射、干燥、通风、防毒、防火、无虫鼠害的常温仓库内，应远离热源， 不应与抗生素、有毒、有害、易污染物质、易燃易爆物品及腐蚀性化学物品混贮。 6 生产记录 6.1 原料进货记录 6.1.1菌种来源、鉴定报告和来源信息记录 。 6.1.2生产原料及辅料记录（进货日期、名称、规格、批号、数量、供货商、索证情况、保质期限、验 收人记录） 6.2 生产过程记录 6.2.1配置培养基过程中的培养基原料领用记录和配制过程记录， 包括试剂名称、 领用数量、 领取时间、DB21/T 4329 —2025 4 领取人、理论值、实际称重值、操作人等信息。 6.2.2建立记载发酵日期、培养时间、灌装日期、菌液颜色、菌数、发酵温度、 pH值等生产过程记录。 6.3 记录档案 建立生产记录档案，记录档案保存 2年以上。