QB ICS 71.100.70 分类号：Y42 备案号：43649-2013 中华人民共和国轻工行业标准 QB/T 4617-2013 化妆品中黄芩苷的测定 高效液相色谱法 Determination of baicalin in cosmetics- Highperformanceliquid chromatography 2014-07-01实施 2013-12-31发布 发布 中华人民共和国工业和信息化部 QB/T46172013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国轻工业联合会提出。 本标准由全国香料香精化妆品标准化技术委员会（SAC/TC257）归口。 本标准起草单位：上海市质量监督检验技术研究院。 本标准主要起草人：周泽琳、杨轶眉、顾宇翔、冯俊、王庆贺。 QB/T4617-2013 化妆品中黄芩苷的测定高效液相色谱法 1范围 本标准规定了用高效液相色谱法测定化妆品中黄苓苷的含量。 本标准适用于水剂、乳剂化妆品中黄芩苷的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682一2008分析实验室用水规格和试验方法 3原理 试样经75%乙醇涡旋振荡、超声提取、离心沉淀、分离过滤、固相萃取（可选）去除杂质后，采用 反相高效液相色谱分离，二极管阵列检测器检测，外标法定量。 4试剂和材料 除非另有规定，所用试剂均为分析纯。水为符合GB/T6682一2008规定的二级水。 4.1乙腈（色谱纯）。 4.2乙醇。 4.3体积分数为75%的乙醇溶液。 4.4磷酸。 4.5体积分数为0.1%的磷酸溶液。 4.6甲醇。 4.7甲酸。 4.8黄芩苷：含量不小于95%，CAS号、分子式、相对分子质量和结构式参见附录A表A.1。 4.9黄芩苷标准储备溶液：准确称取黄苓苷0.0500g于250mL的棕色容量瓶中，用75%乙醇溶液（4.3） 溶解并定容至刻度。此溶液1mL相当于0.200mg黄苓苷。该溶液棕色瓶于4℃冰箱避光可保存7天。 4.10黄苓苷标准工作溶液：分别吸取0.2mg/mL黄苓苷标准储备溶液0.00mL、0.50mL、5.00mL、 10.00mL于100mL棕色容量瓶中，吸取0.2mg/mL黄苓苷标准储备溶液2.00mL、5.00mL于10mL 棕色容量瓶中，再用75%乙醇溶液（4.3）稀释至刻度；配制成浓度为0μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、 20μg/mL、40μg/mL、100μg/mL标准系列溶液。配制好的黄苓苷溶液应于棕色瓶中避光4℃保存。 4.11体积分数为5%的甲酸-甲醇溶液。 4.12氢氧化钠。 4.13质量分数为1%的氢氧化钠溶液。 仪器和设备 5.1高效液相色谱仪：与二极管阵列检测器联用。 5.2分析天平：感量为0.1mg。 5.3分析天平：感量为0.01g。 5.4棕色容量瓶：10mL、100mL和250mL。 5.5具塞离心刻度试管：25mL或50mL。 1 QB/T4617-2013 5.6 超声振荡器 离心机：转速不小于8000r/min。 5.7 滤膜：孔径0.22 材质可用聚四氟乙烯（PTFE） 聚偏氟乙烯（PVDF）或混合纤维素膜。 5.8 5.9 涡旋振荡器。 5.10 阴离子交换固相萃取小柱 5.11 氮吹装置。 5.12 移液管或移液器：2mL和10mL。 分析步骤 6.1 样品处理 6.1.1提取 分析天平取样品1.00g（精确至0.01）于具塞离心刻度试管（5.5中，加入75%乙醇溶液（4.3） 至近10.0ml，涡旋振荡1min， 30℃水浴中超声提取20min，冷却至室温后用75%乙醇溶液（4.3） 补足至10.0mL，8000r/min离心分离5min，上清液经0.22um滤膜过滤。 6.1.2净化 （当需要降低检出限或试样中存在对黄苓苷检测有干扰的杂质时使用） 将阴离子交换固相萃取小柱（5.10）先用5mL甲醇和5mL水活化，然后取6.1.1步骤中离心后的 样品上清液 反5mL加入小柱进行上 可提高离心速度或用滤膜过滤后再上样）。 如上清 上样结束后用5mL甲醇（4.6）洗涤，然后用5%甲酸-甲醇溶液（4.11）5mL洗脱，收集洗脱液氮并 吹干，用75%乙醇溶液（4.3）1mL定容并超声助溶，经0.22μm滤膜过滤。上述过程的 流速均应控制 在1 mL/min。 6.2测定条件 高效液相色谱测定参考条件如下： a）色谱柱规格：C18色谱柱，250mm×4.6mm（内径5μm），或相当者： b）流动相：乙腈（4. 0.1%磷酸（4.5）为22：78（体积比）： c）柱温：30℃ d）流动相流 1.0mL/min e）进样量 10μL; f）检测 长：276nm。 6.3标准工 作曲线绘制 按6.2 色谱条件检测。以标准系列溶液（0μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、 100μg/mL 的浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，进行线性回归得到标准曲线方程。 黄苓苷标准品的 HPLC色谱图参见附录B中的图B.1。 6.4测定 按6.2 （步骤中（采用固相萃取取用6.1.2步骤中）的滤液进样，得到试样溶液 取6.1 的峰面积， ，根据保留时间和极管阵列的光谱图定性，黄苓标准品的DAD光谱图参见附录B中的图 B.2。从标准曲 线上查得试样溶液中黄苓的含量。若在相同保留时间出现干扰峰且无法用固相萃取去 除时，可用1%氢 氧化钠溶液（4.13）调节流动相的pH为2.5或3，黄苓苷的保留时间会相应提前，借 此可判断样品中是否存在黄芩苷。 试样溶液中黄苓者的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应将提取液稀释后测定或增 加提取溶液的量重新检测。 6.5空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤进行。 2 QB/T4617-2013 6.6平行试验 样品中的黄苓苷含量应根据两次独立的平行试验结果的算术平均值确定。 结果计算 7 试样中的黄苓苷含量按公式 (1) 计算： C×V×1000 XF mx1000 式中 试样中黄苓苷的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； X 从标准曲线中得出的黄苓替浓度（应扣除空白值），单位为微克每毫升（μg/mL）； c 试样溶液的体积， 单位为毫升（mL） 4 为克（g）； 试样质量，单位 m 不采用固相萃取日 时为1，来用固相萃取时为0.2。 F 计算结果保留3位有效数字 检出限和定量限 8 mg/kg：使用固相萃取时检出限、定量 本方法黄芩苷的检出 下限分别为3.0mg/kg、10.0mg/kg。 回收率和精密度 样品在添加浓度为16mg/kg~82mg/kg的范围内，回收率在81.3%104.5%之间，相对标准偏差 小于7%。 10 允许差 在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10% QB/T4617-2013 附录A （资料性附录） 黄芩苷的CAS号、分子式、相对分子质量和结构式 表A.1黄芩苷的CAS号、分子式、相对分子质量和结构式 中文名称 黄芩苷 英文名称 β-D-Glucopyranosiduronic acid, 5, 6-dihydroxy-4-oxo-2-phenyl-4H- 1-benzopyran-7-yl INCI名称 Baicalin CAS号 21967-41-9 分子式 C2,Hi8O1 相对分子量 446.36 OH HO. 结构式 OH HO OH OH QB/T4617-2013 附录B （资料性附录） 黄苓苷标准品HPLC色谱图和DAD光谱图 0.010 0.000 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 分钟 黄芩苷参考保留时间15.5min。 图B.1 黄苓苷标准品的HPLC色谱图 0.10-14.5 275.9 0.08 0.06 316. 0.04- 0.02 0.00 220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 320.00 340.00 360.00 380.00 400.0 /nm 图B.2 黄苓苷标准品的DAD光谱图