中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2863—2011 马脑脊髓炎（东部型和西部型） 检疫技术规范 Quarantine protocol for equine encephalitis (eastern and western) 2011-05-31发布 2011-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2863—2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准修改采用了世界动物卫生组织（OIE)的《陆生动物手册（2009版）第2.5.5章“马脑脊髓炎 （东部型和西部型）”。除编辑性修改外，主要技术变化如下： 一细化了免疫荧光试验方法； 一细化了逆转录聚合酶链式反应检测方法； -增加了血凝试验内容； 一修改了IgM捕获ELISA的底物作用时间为30min～35min； 删除了补体结合试验。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国重庆出人境检验检疫局、重庆市进出口食品安全工程技术研究中 心、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：王昱、李应国、肖进文、梁成珠、聂福平、刘生峰、王国民、李贤良、周启明。 SN/T2863—2011 马脑脊髓炎（东部型和西部型） 检疫技术规范 范围 本标准规定了东部型马脑脊髓炎和西部型马脑脊髓炎的病毒分离、免疫荧光试验、RT-PCR试验、 血凝抑制试验、IgM捕获ELISA和蚀斑减数中和试验的技术要求。 本标准适用于进出境动物的冻部型马脑脊髓炎和西部型马脑脊髓炎的检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本(包括所用的修改单)适用于本文件。 GB/T18088出人境动物检疫采样 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 3.1 EEE(eastern equine enc litis）：冻部型马脑脊髓炎 3.2WEE（westernequineencephalitis）：西部型马脑脊髓炎 3.3VEE（venezuelanequineencephalitis）：委内瑞拉马脑脊髓炎 3.4WN(westnilefever)西尼罗河热 3.5RK-13细胞系（rabbitki&ney-13(celllihe）：兔肾细胞系 monkeykidneycell line:非洲绿猴肾细胞系 3.6Vero细胞系（africangre 3.7 RT-PCR(reversetranscrip Ption-polymerasechainreaction）：逆转录聚合酶链式反应 4 生物安全要求 本标准的病毒分离、免疫荧光试验和蚀斑减数中和试验，均需在生物安全Ⅲ级以上的实验室进行。 实验人员需提前进行EEE疫苗免疫，蚀斑减数中和抗体滴度在1：40以上。 5样品采集 5.1试剂和材料 采血针、离心管、样品瓶、手术镊子、开颅钳、断骨刀、手术剪刀、样品缓冲液（配制见A.1.3)。 5.2采样数量和类型 采样的数量按照GB/T18088的要求执行。样品类型包括：血清、脑脊液、组织脑和（或）脊髓］。 1 SN/T2863--2011 5.3采集方法 5.3.1血清样品 采集全血10mL～15mL，提取血清3mL以上，立即低温运送到实验室。 5.3.2脑脊液样品 无菌采集脑脊液1mL以上，立即低温运送到实验室。 5.3.3组织样品 无菌采取动物脑、脊髓，存放于无菌样品瓶，低温48h内运送到实验室。如果48h内无法运送到 实验室，则需干冰冷冻运送。 5病原分离鉴定 6 6.1病毒分离 6.1.1设备和器材 低温冰箱、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、冷冻离心机（≥3000g）、生物安全柜（ClassⅡ以上）、倒置 光学显微镜、细胞瓶、注射器、移液器（1.0mL~10mL)及配套枪头。 6.1.2试剂和材料 6.1.2.1RK-13和(或)Vero细胞。 6.1.2.2MEM培养基。 6.1.2.33日龄～5日龄乳鼠。 6.1.2.46日龄～8日龄SPF鸡胚。 6.1.2.5胎牛血清（无BVDV抗体及其他牛病抗体）。 6.1.2.6 样品缓冲液，配制见A.1.3。 6.1.2.7 细胞生长液和维持液，配制见A.2.1。 6.1.2.8 ATV缓冲液，配制见A.2.2。 6.1.3# 操作方法 6.1.3.1 样品制备 组织样品低温均质后，加入样品缓冲液制成10%悬液，1500g，4℃离心20min。取上清液过滤除 菌，置冰盒备用。血清、脑脊液直接使用。 6.1.3.2细胞分离试验 用适量ATV缓冲液，将培养的RK-13细胞和（或）Vero细胞传代。待细胞长至80%～100%，每瓶细胞 按10%体积加入样品悬液，37℃感作1h～2h后加入细胞维持液，37℃培养6d～8d，逐日观察细胞病变。 每份样品接种RK-13和(或)Vero细胞各2瓶，同时设定正常培养细胞对照。若第一代培养中无细胞病变，则 将细胞反复冻融3次，合并两瓶细胞培养物上清液，取适量上清液感染新的单层细胞；将出现70%～90%细胞 病变的细胞培养物反复冻融后，取上清液进行RT-PCR和(或)免疫荧光试验鉴定。 2 SN/T2863—2011 6.1.3.3鸡胚分离 每份样品接种2枚～4枚6日龄～8日龄SPF鸡胚卵黄囊，0.5mL/枚，孵化7d。弃24h内死亡鸡胚，收 集24h后死亡鸡胚，用RT-PCR和(或)免疫荧光试验鉴定。若第一代鸡胚无死亡，再盲传一代。 6.1.4结果判定 6.1.4.1细胞分离试验 细胞对照无任何细胞病变，细胞生长良好，试验成立。若被检样品连传两代均无细胞病变，判定为 阴性；若出现圆缩、脱落等细胞病变，进一步进行RT-PCR和（或）免疫荧光试验。 6.1.4.2鸡胚分离试验 若连传两代，均无鸡胚死亡，判定为阴性；若出现鸡胚死亡，进一步进行RT-PCR和(或)免疫荧光试验。 6.2免疫荧光试验 6.2.1设备和器材 二氧化碳培养箱、生物安全（ClassⅡ以上）、倒置荧光显微镜、低温冰箱、超低温冰箱、Leighton试 管和移液器等。 6.2.2试剂和材料 6.2.2.1丙酮。 6.2.2.2 2Vero细胞。 6.2.2.3 3MEM培养基。 6.2.2. 4 40.5%伊文思蓝染色液。 6.2.2.5 EEEV和WEEV病毒储液。 6.2.2.6 阴性血清（和一抗来源相同）。 6. 2.2.7 一抗[EEEV抗体和（或）WEEV抗体]。 FITC标记二抗（FITC标记物种特异性抗体）。 6.2.2.8 6.2.2.9 FITC标记一抗[EEEV抗体和（或）WEEV抗体]。 6.2.2.10细胞生长液和维持液，配制见A.2.1。 6.2.2.11 ATV缓冲液，配制见A.2.2。 6.2.2.12 PBS溶液.配制见A.3.1。 6.2.2.13封闭溶液（含封闭液1和封闭液2)，配制见A.3.2。 6.2.2.14封固溶液，配制见A.3.3。 6.2.3操作方法 6.2.3.1准备试验 6.2.3.1.1加人ATV缓冲液，将Vero细胞传代到Leighton试管，37℃，5%二氧化碳培养1d2d。 待细胞长至80%～100%，取0.1mL待鉴定的分离培养物感染Vero细胞，每个样品接种6支7支 Leighton试管，同时设立1支2支正常培养细胞对照。用MEM培养基将EEEV和WEEV病毒储液 稀释到100TCIDso～1000TCIDso后感染Vero细胞，作阳性对照。加人适量细胞维持液，37℃，5%二 氧化碳培养。 3 SN/T2863—2011 6.2.3.1.2逐日取出一块玻片，PBS溶液润洗一次，一70℃预冷丙酮固定5min～10min。 6.2.3.1.3滴加FITC标记一抗，37℃湿盒孵育25min～45min后，PBS溶液润洗一次。 6.2.3.1.4用新鲜PBS溶液浸泡5min~10min，双蒸水润洗1次，空气中干燥，滴加一滴封固溶液， 加盖片，用荧光显微镜（490nmol/L)进行观察。确定出最佳感染效果后，将余下的玻片固定备用。 6.2.3.1.5组织冰冻切片，丙酮固定5min～10min；组织涂片空气中干燥30min，丙酮固定。将固定 好的片子密闭、保存于－70℃备用。 6.2.3.2染色 6.2.3.2.1直接免疫荧光抗体法 每个样品同时做两张片子，分别用封闭液T和封闭液2进行封拟37℃湿盒孵育30min，滴加 FITC标记一抗，按6.2.3.1.2～6.2.3.1.4进行孵育、洗涤、干燥和观察 6.2.3.2.2间接免疫荧光抗体法 滴加一抗，37℃湿盒孵育25min~45min。PBS润洗一次后，再用新鲜PBS浸泡5min~10min， 双蒸水润洗一次，置玻片架上，细胞面向上，滴弧FITC标记二抗，按6.2.3.1.2～6.2.3.1.4进行孵育、 洗涤、干燥和观察。用相同比例稀释的阴性血清作阴性对照。 注：工作浓度未知的一抗，可以作110，1：20，1：40，F80,！T60梯度带释，作用于阳性对照进行染色。 6.2.4结果判定 阳性对照出现特异性荧光，正常细胞对照无在荷特异性荧光，且阴性血清对照无特异性荧光，试验 成立；样品呈现特异性荧光，判定为阳性；样品无特异性荧光，判定为阴性。 6.3逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 6.3.1设备和器材 生物安全柜、低温冰箱、超低温冰箱、高速冷冻离心机（≥12obog）、PCR仪、凝胶电泳仪、凝胶成像 仪（或UV灯）、微量移液器（0.5uL~10Q0μ 吸配套枪头等。 6.3.2试