中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2452—2010 绵羊痘和山羊痘检疫技术规范 Protocol of the quarantine for sheep pox and goat pox 2010-01-10发布 2010-07-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 数码防伪 SN/T 2452-2010 言 本标准参照OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2008年）中第2.7.14章制定。 本标准的附录A、附录B、附录C和附录D均为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局 本标准主要起草人：王海艳、刘中学、赵林立、刘虹、敖威华、高志强、季新成、薛强、乔彩霞、任立新。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T2452—2010 绵羊痘和山羊痘检疫技术规范 1范围 本标准规定了绵羊痘和山羊痘流行病学调查、临床症状与病理学观察、实验室检测等技术内容。 本标准适用于绵羊痘和山羊痘的诊断、检疫。 2设备和材料 2.1恒温培养箱、恒温水浴箱、冰箱。 2.2生物显微镜、透射电子显微镜。 2.3高压灭菌器、高速冷冻离心机。 2.4单道微量加样器：1μL~10μL，100pL，200μL，1000μL。 2.5细胞培养瓶：25cm²。 2.6酶标仪、蛋白凝胶电泳仪、电转印仪。 3培养基和试剂 3.1Hank's液：见附录A第A.1章。 3.20.25%胰酶消化液：见附录A第A.2章。 3.3MEM细胞培养液：具体配制方法按厂家规定的程序进行，用0.2μm的滤膜过滤除菌，分装于小 瓶中，4℃保存备用。 3.4EDTA-胰蛋白酶分散液：见附录A第A.3章。 3.5抗生素溶液：见附录A第A.4章。 3.6绵羊痘和山羊痘抗原及相应的标准阴性血清和标准阳性血清。 3.7青霉素、链霉素、制霉菌素（或两性霉素）、新霉素。 3.8PBS溶液：见附录A第A.5章。 3.910×Tris-甘氨酸电泳缓冲溶液（pH8.3)：见附录A第A.6章。 3.10转移缓冲溶液：见附录A第A.7章。 3.11 硝酸纤维素膜、胎牛血清、蛋白质分子量Marker、牛血清白蛋白、辣根过氧化物酶标记的兔（或小 鼠)抗羊IgG。 3.1212%分离胶：见附录第A.8章。 3.135%的积层胶：见附录A第A.章。 3.141XSDS凝胶上样缓冲液：见附录A第A.10章。 3.15 考马斯亮蓝染色液：见附录A第A.11章。 3.16 1%磷钨酸溶液（pH7.2)：见附录A第A.12章。 3. 17 琼脂板：见附录A第A.13章。 3.18 底物溶液：见附录A第A.14章。 3.19 苏木素染色液：见附录A第A.15章。 3.20 0.5%伊红染色液：见附录A第A.16章。 3.21 无水乙醇、二甲苯。 3.22 石蜡：熔点分别为52℃～54℃，54℃～56℃，56℃～58℃。 3.23 绵羊羔睾丸细胞的制备：见附录B。 SN/T2452—2010 4临床症状 见附录C。 5检测方法 5.1病毒电镜观察 5.1.1将活体或死后的皮肤丘疹、肺部的病灶或淋巴结用灭菌剪刀和镊子切碎后，放人灭菌的研钵内 加入灭菌砂后进行研磨。研碎后加人等体积含抗生素（青霉素[1000单位/mL]，链霉素[1mg/mL]， 制霉菌素[100单位/mL]或两性霉素[2.5μg/mL]，新霉素[200单位/mL])的PBS溶液制成样品悬液。 将样品悬液反复冻融三次后，于6Q0g.离心10_min，取上清液保存备用。 5.1.2取一滴上清液置于载玻片上，将400目碳网膜漂浮于液滴上1min，再置于一滴Tris-EDTA缓 冲液中浸泡20s，然后用一滴1%的磷钨酸溶液（pH7.2)染色10s。取出碳网膜，用滤纸吸干膜上液体， 待自然干燥后镜检。 5.1.3结果判定：羊痘病毒颗粒应呈砖形，其表面有短管状物覆盖，大小约290nm×270nm。有些病 毒粒子周围有寄主细胞膜包裹。 5.2包涵体检查 5.2.1病料采集 采集病变组织用于组织学检测，病变组织周围应该连带一些健康组织，采集后的组织立即放人 10%的福尔马林溶液中固定24h， 5.2.2切片制备 将用福尔马林溶液固定的组织材料按照常规石蜡切片的制备方法制备切片。制备方法见附录D 中第D.1章。 5.2.3染色 用H-E染色法进行染色，H-E染色方法见附录D中第D.2章。 5.2.4结果判定 染色后的切片置光学显微镜下观察。羊痘感染病料的组织细胞，细胞质内应有不定形的噬酸性包 涵体，细胞核内有空泡。 5.3琼脂扩散试验 5.3.1操作方法 5.3.1.1被检抗原悬液的制备 丸细胞单层，弃去培养液，每瓶接种1mL接种物，接种后于37℃温箱吸附1h（期间轻轻摇动两次），用 PBS溶液洗去残余接种物，然后加入MEM细胞培养液（内含3%～5%胎牛血清和1%抗生素溶液） 10mL，置37温箱中培养。当细胞病变达90%时，收获细胞，反复冻融两次后，于4000r/min离心 15min，将大部分上清液移入另外的洁净容器内。用剩余的上清液将沉淀重悬，用超声波裂解1min 后，于4000r/min离心15min，将上清液与第一次离心收集的上清液混合。将收集的上清液加人等体 积的饱和硫酸铵溶液（pH7.4）于4℃作用1h。将该溶液于4000r/min离心15min，收集沉淀并用 0.8%的生理盐水0.1mL～0.5mL重悬后作为被检抗原悬液。 5.3.1.2打孔 在制备的琼脂板上打7个孔，中央1个，周围6个，孔径约5mm，周围各孔间及各孔与中央孔间距 7mm。将孔中的琼脂用针头轻轻挑出或吸出，勿伤边缘，以免渗漏。 5.3.1.3封底 用酒精灯烤琼脂板底部，封闭孔的底部，以防侧漏。 2 SN/T 24522010 5.3.1.4加样 用微量移液器吸取18μL羊痘标准阳性血清加人中央孔，在周围三个孔中隔孔加人18μL标准抗 原悬液，将按照5.3.1.1的方法制备的18μL被检抗原悬液加入其余三个外周孔中。每加一种样品更 换一次吸头。 5.3.1.5作用 加样完毕后，静置5min10min，待孔中液体全部渗人琼脂后将平皿倒置放入湿盒内，于室温下放 置，分别于24h、48h及72h后观察并记录结果。 5.3.2结果判定 将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准抗原悬液孔与中心标准阳性血清孔之间出现一条清晰 致密的白色沉淀线，则试验成立，否则视为无效-需重做。 若被检抗原悬液孔与中心标推阳性血清孔之间出现沉淀线，并与标准抗原悬液孔的沉淀线末端相 吻合，则被检样品判为阳性。 若被检抗原悬液孔与中心标准阳性血清孔之间未出现沉淀线，但标准抗原悬液孔的沉淀线一端弯 向被检抗原悬液孔，则被检样品判为弱阳性，凡弱阳性者应重复试验，仍为弱阳性者，判为阳性。 若被检抗原悬液孔与中心标准阳性血清孔之间未出现沉淀线且标准抗原悬液沉淀线直向被检抗原 悬液孔或向其外侧偏弯，则被检样品判为阴性。 若被检抗原悬液孔与中心标准阳性血清孔之间的沉淀线与标准抗原悬液孔和中心标准阳性血清孔 之间的沉淀线交叉直伸，则判为非特异性反应，应重复该试验。若仍出现非特异性反应则判为阴性。 5.4中和试验 5.4.1稀释 5.4.1.1抗原稀释 将按照5.1.1的方法制备的上清液作为待检向疑病料，用Hank's液分别将待检可疑病料和羊痘 病毒标准对照作1：100倍稀释。 5.4.1.2标准阳性血清稀释 用Hank's液将标准阳性血清做1：2倍稀释。 5.4.2加样 5.4.2.1取两支试管分别加人待检可疑病料稀释液0.5mL向其中一支试管中加入等量标准阳性血 清稀释液，向另一支试管中加人等量Hank's液。 5.4.2.2另取两支试管，向其中一支试管中加人羊痘抗原稀释液0?5mL，向另一支试管中加入标准阳 性血清稀释液0.5mL，然后分别加人等量Hanks液作为羊痘病毒标准对照和阳性血清对照。 5.4.3中和 将各试管混合物摇匀后置37℃水浴中和1h，期间每隔15min振摇一次。 5.4.4接种 将每管混合物分别接种两瓶绵羊睾丸单层细胞。接种时，取覆盖面达90%的绵羊睾丸细胞单层， 弃去培养液，每瓶接种1mL接种物，接种后于37℃温箱吸附1h（期间轻轻摇动两次），用PBS溶液洗 去残余接种物，然后加人MEM细胞培养液（内含3%～5%胎牛血清和1%抗生素溶液）10mL，置 37℃温箱中培养。同时设两瓶正常细胞对照。 5.4.5观察 每天观察细胞病变情况，观察4d～6d。病变细胞的特征是细胞出现间隙，形成圆细胞并聚积成 簇，胞浆内颗粒增多，显示出退行性变化，失去正常形态，最终呈网状并脱落。 5.4.6结果判定 当正常对照细胞和阳性血清对照细胞均不出现细胞病变，而接种羊痘抗原的细胞出现细胞病变，试 验成立，否则试验失败，应该重做。 3 SN/T2452—2010 当中和后的待检可疑病料接种的细胞不出现细胞病变，而未经中和的待检可疑病料接种的细胞出 现与羊痘抗原接种的细胞相同的病变，则判待检样品中含有羊痘病毒。 当中和后的待检可疑病料和未经中和的待检可疑病料接种的细胞均不出现细胞病变，则判待检样 品中不含羊痘病毒。 5.5Westernblot分析 5.5.1病毒表达蛋白的样品制备 取覆盖面达90%的绵羊睾丸细胞单层，弃去培养液，每瓶接种1mL羊痘病毒，接种后于37℃温箱 吸附1h(期间轻轻摇动两次），用PBS溶液洗去残余接种物，然后加入MEM细胞培养液（内含3