SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3499—2013 新孢子虫病检疫技术规范 Quarantineprotocolforneosporosis 行业标准信息服务平台 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3499—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国新疆出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：季新成、员丽娟、哈森、段晓东、于学辉、史茜、唐慧芬。 行业标准信息服务平台 SN/T3499—2013 新抱子虫病检疫技术规范 1范围 本标准规定了新孢子虫病组织病理学检查、聚合酶链反应、实时荧光PCR和间接酶联免疫吸附试 验的技术要求。 本标准适用于新孢子虫病的检疫。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。 3概述 新孢子虫病（Neosporosis）是由犬新孢子虫（Neosporacaninum）寄生在宿主体内引起的一种多种 家畜共患的原虫病，呈世界性分布。犬是新孢子虫的终末宿主，牛、羊、犬、马、鹿、小鼠等均可作为中间 宿主。该病对牛的危害尤为严重，主要造成母牛流产、产死胎以及新生儿的运动神经系统疾病。 行业标准信息服务平台 4设备和材料 4.11 仪器和器材 4.1.1石蜡切片机。 4. 1. 2 展片台。 4. 1.3 平板烘片机或恒温干燥箱：室温至100℃ 4.1.4 显微镜：带高倍镜（40X）和油镜（100×）。 4.1.5 高速离心机。 4.1.6 PCR扩增仪。 4. 1. 7 凝胶成像分析仪。 4. 1. 8 荧光PCR扩增仪。 4. 1. 9 酶标仪。 4.2 试剂和溶液 4.2. 1 迈尔-班尼特苏木精（Mayer-BennettHematoxylin）染色液（见附录A的A.1）。 4.2.21%伊红存液（见A2）。 4. 2. 3 PBS液（见A.3)。 4.2. 4 固定液（见A.4）。 4.2.5 甘油蛋白贴片剂（见A.5）。 4.2.6DNA提取试剂商品化DNAzol,也可自行配制基因组DNA提取试剂。 1 SN/T 3499—2013 4.2. 7 TE缓冲液（见A.6）。 4.2.810XPCR缓冲液（见A.7）。 4.2.91X电泳缓冲液（1XTBE)（见A.8）。 4.2.1010×加样缓冲液（见A.9）。 4.2. 11 10mg/mL溴化乙锭溶液（见A.10）。 4. 2. 12 TaqDNA聚合酶。 4.2. 13 25 mmol/L MgCl2 4.2. 14 dNTPs(dCTP,dGTP、dATP、dTTP各 10 mmol/L)。 4.3 引物和探针 4.3.1PCR检测引物 根据犬新孢子虫NC-5基因序列，设计扩增相应序列的PCR扩增引物。 NCF:5-GGGTGAACCGAGGGAAT-3'; NCR:5'-TCGCCAGTCAACCTACG-3。 扩增条带长度为231bp。 4.3.2荧光PCR检测引物和探针 根据犬新孢子虫NC-5基因序列，设计扩增扩增引物和荧光探针。 Np:5'-GTG GTT TGT GGT TAG TCA TTC G-3'; Nr:5'-GCA TAA TCT CCC CCG TCA TCA G-3'; NTprO:5'-FAM-CACGTTGAAATCAGCCTGCGTCAG-ECLIPSE-3'。 扩增片段长度为138bp。 行业标准信息服 临床症状与病理变化 参见附录B。 6 组织病理学检查 6.1样品制备 选择新鲜的脑、肌肉、肝等组织，以脑组织为主，取样大小约为1.5cm 1.5cm×1cm,在1h之内 中，烧杯口再用单层纱布扎口，放于自来水下，轻柔冲洗12h。 6.2切片的制备 见附录C。 6.3观察 明视野显微镜下观察（40X）。 6.4结果判定 单个速殖子呈圆形、卵圆形或月芽形，并随分裂期的不同而有所差异，大小约为（1um3um）× 2