SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3306.12-2017 国境口岸环介导恒温扩增（LAMP） 检测方法 第12部分：空肠弯曲菌 Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port- Part12:Campylobacterjejuni 2017-12-01实施 2017-05-12发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3306.122017 前 創言 SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》分为14个部分： 第1部分：鼠疫杆菌； 第2部分：产毒素霍乱弧菌； 第3部分：志贺氏菌； 第4部分：嗜肺军团菌； 第5部分：布鲁氏菌； 第6部分：黄热病毒； 第7部分：猴痘病毒； 第8部分：基孔肯雅病毒； -第9部分：结核分枝杆菌； 第10部分：炭疽芽孢杆菌； 第11部分：副溶血性弧菌； 第12部分：空肠弯曲菌； -第13部分：原虫； 第14部分：大肠杆菌0157：H7。 本部分为SN/T3306的第12部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国山西出入境检验检 疫局。 本部分主要起草人：詹曦菁、李君萍、柴宏森、祁军。 I SN/T3306.12—2017 上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子 与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁)形成乳白色沉淀，即可通过反应液中的浑浊程度判 定结果。亦可通过加人显色液，通过颜色变化观察判定结果。 6试剂和材料 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。 6.1引物。 根据空肠弯曲菌特有的hipO靶序列基因设计一套特异性引物，包括外引物1,外引物2，内引物1， 内引物2和环状引物1,环状引物2。 外引物1(F3,5-3")GAAGAAGCCATCATCGCA 外引物2(B3,5-3")：AATAGGACTTCGTGCAGATATG 内引物1(FIR，5-3）：TGCTGAAGAGGGTTTGGGTGCATATTGTGCCATCCA 引物2(BIP,5'-3")：GCTAAATACTTTGCAGCAAGCAGCTTTGCCTTTACAAGAATGC 环状引物1LF,5"-3"):GGTGCTAAGGCAATGATAGAAG 环状引物2(LB，5"-3"）：CATCATGACCGCAAGCATG 6.2 DNA提取液：含20mmol/LTris-HCl（pH8.0）)、2mmol/LEDTA和1.2%TritonX-100。 6.3dNTPs：每种核苷酸浓度10mmol/L。 6.4 BstDNA聚合酶：8U/μL。 6.5 10×ThermoPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCI（pH8.8）、100mmol/L（NH,),SO，、 100mmol/LKCl.20mmol/LMgSO、1%TritonX-100。 6.6 MgSO，溶液：25mmol/L。 6.7 甜菜碱：5mol/L。 6.8 显色液：浓度为1000×SYBRGreenI。 6.9 阳性对照：可溯源的标准菌株，或含目的片段的DNA亦可。 6.10 Bolton肉汤。 6.11 0.2mL和1.5mL、10mL塑料离心管。 6.12 吸头，配套移液器使用。 6.13 无菌匀质袋（带滤网）。 仪器设备 移液器：量程0.1μ～2μ，量程0.5μ10μl，量程10μl～100μ，量程100μ~1000μ。 7.2 高速台式离心机：≥7000g。 7.3 水浴锅或加热模块：65℃±1℃和100℃土1℃。 7.4恒温培养箱：36℃士1℃和42℃士1℃。 7.5 微需氧培养装置：提供微需氧培养条件（5%)：、10%C)：、85%N.）。 7.6 计时器。 8检测程序 空肠弯山菌检测程序见图1。 2 SN/T3306.12—2017 样本采集 样本的增菌及分离培养 样本前处理 模板DNA提取 LAMP反应 阴性 阳性 结果报告 经分离培养鉴定确认 图1 空肠弯曲菌LAMP检测程序 9 操作步骤 9.1 样本采集、细菌增菌及分离培养 按照GB4789.9、WS271执行。 9.2样本前处理 9.2.1粪便样本的前处理 选取黄豆大小的成型便，每份标本湿重约4g，收集在无菌塑料袋中，4℃冰箱保存。预处理时每份 粪便标本放置于装有6mLPBS(0.05mol/L.pH7.4)的离心管中，振荡混匀5min～10min后，500g 离心5min，收集上清液，此步骤重复3次。然后上清液4000g离心10min，收集沉淀，沉淀重悬于1 mL双蒸水（ddH.))中，7000g离心5min，收集沉淀。将沉淀溶于200μl（-20℃）预冷的无水乙醇 中，振荡混匀后，7000g离心2min，弃上清液，此步骤重复3次，最终保留沉淀备用。水样便无需前处 理，可直接用于后续DNA提取。 9.2.2食物标本的前处理 取可疑食物约25g放人盛有225ml.Bolton肉汤的有滤网的无菌匀质袋中，用拍击式匀质器匀质 约1min～2min.将滤液在微需氧条件下，36℃士1℃培养4h.之后42℃±1℃培养48h增菌。取该 增菌液1ml.加到1.5ml.无菌离心管中，7000g离心2min保存沉淀备川。 3 SN/T 3306.12—2017 9.2.3 可疑菌落的前处理 分离培养后得到的可疑菌落直接用于提取DNA模板，无需前处理。 9.3 3模板DNA的提取 9.3.1 加热煮沸法 向前处理后得到的沉淀中加人100μLDNA提取液；水样便直接取100μL加人100μLDNA提取 液；直接挑取1个～2个可疑菌落加人100μLDNA提取液。之后将上述提取混合液其置于沸水浴 10min，7000g离心2min，收集上清液作为扩增模板，于一20℃保存备用。 9.3.2试剂盒提取 按适用于细菌基因组提取的试剂盒说明书操作。 9.4 环介导恒温核酸扩增 9.4.1 反应体系 空肠弯曲菌的hipO基因环介导引物恒温扩增反应体系见表1。亦可使用市售商品化检测试剂盒。 表1 空肠弯曲菌环介导引物恒温扩增反应体系 体系加样量 试剂名称 储备液浓度 μL, 10XThermoPol缓冲液 5.0 F3引物 10μmol/L/ 0.5 B3引物 10μmol/L 0.5 FIP引物 40μmol/L 0.8 BIP引物 40 μmol/L 0.8 LF引物 100μmol/L 0.4 LB引物 100μmol/L 0.4 dNTPs 10.mmol/L 7.0 甜菜碱 5mol/L 12 硫酸镁溶液 150 mmol/L 8.0 BstDNA聚合尊 8 U/μl. 1 模板 5 ()"HPP 8.6 9.4.2 反应过程 按照表1所述配制反应体系，上述组分加人后轻柔混匀并短暂离心后加人10μL的凡士林（密封 液），最后将1uL的显色液加人反应管顶端。盖上管盖后，置于65℃恒温扩增60min，观察结果。 9.4.3 空白对照、阴性对照、阳性对照设置 每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。 4 SN/T 3306.12—2017 空白对照则采用无菌水作为扩增模板。 阴性对照以DNA提取液代替DNA模板。 阳性对照以含检测序列的质粒DNA作为扩增模板。 9.5结果观察 取出反应管，短暂离心使反应管盖中显色液进入反应体系，3min后根据管内反应液颜色变化，判 断结果。 9.6 结果判定 在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下： 阳性结果：待检样品反应管液体呈绿色，则该样品检验结果报告为LAMP检测阳性。如需对 a)） 上述结果进行确认，则需进行分离培养鉴定.可按GB4789.9、WS271执行。 b） 阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色，则该样品检验结果报告为LAMP检测阴性。