SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3306.11-2017 国境口岸环介导恒温扩增 (LAMP)检测方法 第11部分：副溶血性弧菌 Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part 11:Vibrio parahaemolyticus 2017-05-12发布 2017-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3306.11—2017 前言 SN/T3306国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》分为14个部分： 第1部分：鼠疫杆菌； 一第2部分：产毒素霍乱弧菌； 第3部分：志贺氏菌； 第4部分：嗜肺军团菌； 第5部分：布鲁氏菌； 第6部分：黄热病毒； 第7部分：猴痘病毒； 第8部分：基孔肯雅病毒； -第9部分：结核分枝杆菌； 第10部分：炭疽芽孢杆菌； -第11部分：副溶血性弧菌； 第12部分：空肠弯曲菌； 第13部分：症原虫； 第14部分：大肠杆菌0157：H7。 本部分为SN/T3306的第11部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫 局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：李智慧、王飞、闫冀焕、潘娟、柴宏森、祁军。 I SN/T3306.11—2017 国境口岸环介导恒温扩增 (LAMP）检测方法 第11部分：副溶血性弧菌 1范围 SN/T3306的本部分规定了在国境日岸利用环介导恒温核酸扩增（LAMP)法检测副溶血性弧菌 的检测对象、检测程序及检测结果的报告 本部分适用于国境口岸副溶血性弧菌菌株的筛选检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB4789.7食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR)技术的应用 WS271感染性腹泻诊断标准 人间传染的病原微生物名录（卫科教发【2006]15号） 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Betaine：甜菜碱。 Bst酶：BstDNA聚合酶（大片段）[BstDNApolymerase(largefragment)] DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside-triphosphate） EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid) LAMP：环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalamplification） TritonX-100:聚乙二醇辛基苯基醚 4 生物安全及防污染措施 实验生物安全要求、操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的规定执行，由通 过生物安全培训并具备资质的工作人员进行。防止污染措施应符合WS/T230的规定。 5技术概要 根据副溶血性弧菌的特异性毒力基因序列设计特异性内外引物及环状引物各一对，共三对引物，特 1 SN/T3306.11—2017 异性识别靶序列上的M36437基因，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合 成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的 焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，即可通过反应液中 的浑浊程度判定结果。亦可加人显色液，通过观察颜色变化判定结果。 6试剂和材料 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。 6.1引物。 引物2和环状引物1,环状引物2。 外引物1（F3,5'-3）：AGCTACTCGAAAGATGATCC 外引物2(B3,5*-3'）：GGTTGTATGAGAAGCGATTG 引物1(FIP,5'-3"):ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT 内引物2(BIP,5'-3"）：ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG 环状引物1（LF5"-3"）：ACCAGTAGCCGTCAATG 环状引物2(LB,5-3'）：TTAGATTTGGCGAACGAGA 6.2DNA提取液：含20mmol/LTris-HCl(pH8.0)、2mmol/LEDTA和1.2%TritonX-100。 6.3dNTPs：每种核苷酸浓度10mmol/L。 6.4J BstDNA聚合酶：8U/μL。 6.5 10×ThermoPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.8）、100mmol/L（NH.),SO. 100mmol/LKCI.20mmol/LMgSO;、1%TritonX-100。 6.6MgSO溶液：25mmol/L。 6.7 甜菜碱：5mol/L。 6.8 显色液：浓度为1000×SYBRGreenI。 6.9 阳性对照：可溯源的标准菌株，或含目的片段的DNA亦可。 6.10 3%氯化钠碱性蛋白陈水。 6.11 0.2mL、1.5mL和10mL塑料离心管。 6.12 吸头，配套移液器使用。 6.13 无菌匀质袋（带滤网）。 仪器和设备 7.1 移液器：量程0.1μ~2μ，0.5μ~10μ，量程10μ~100μl，量程100μ~1000μl。 7.27 高速台式离心机：≥7000g。 7.3水浴锅或加热模块：65℃±1℃和100℃±1℃。 7.4恒温培养箱：36℃±1℃和42℃±1℃。 7.5 拍打式匀质器。 7.6计时器。 8检测程序 副溶血性弧菌LAMP检测程序见图1。 2 SN/T3306.11—2017 样本采集 样本的增菌及分离培养 样本前处理 模板DNA提取 LAMP反应 阴性 阳性 结果报告 经分离培养鉴定确认 图1副溶血性弧菌LAMP检测程序 9操作步骤 9.1 样本采集、细菌增菌及分离培养 按照GB/T4789.7、WS271执行。 9.2样本前处理 9.2.1 粪便样本的前处理 选取黄豆大小的成形便，每份标本湿重约4g，收集在无菌塑料袋中，4℃冰箱保存。预处理时每份 粪便标本放置于装有6ml.PBS(0.05mol/L，pH7.4)的离心管中，振荡混匀5min～10min后，500g 离心5min，收集上清，此步骤重复3次。然后上清液4000g离心10min，收集沉淀，沉淀重悬于1mL 双蒸水（ddHz0)中，7000g离心5min，收集沉淀。将沉淀溶于200μl（一20℃）预冷的无水乙醇中， 振荡混匀后，7000g离心2min，弃上清，此步骤重复3次，最终保留沉淀备用。水样便无需前处理，可 直接用于后续DNA提取。 9.2.2食物标本的前处理 取可疑食物约25g放人盛有225mL3%氯化钠碱性蛋白陈水的有滤网的无菌匀质袋中，用拍击式 匀质器匀质约1min2min，将滤液于36℃士1℃培养8h～18h增菌。取该增菌液1mL加到1.5mL无 菌离心管中，7000g离心2min保存沉淀备用。 3