SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1501—2015 代替SN/T1501—2Q04 野兔热检疫技术规范 Quarantineprotocol fortularemia 2015-05-26发布 2016-01-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1501—2015 前言 本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草 本标准代替SN/T1501一2004《野兔热病原分离鉴定操作规程》。 本标准与SN/T1501相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下： 增加临床诊断； -增加聚合酶链反应（PCR)和荧光聚合酶链反应（荧光PCR）； 删除了细菌生化试验，具体内容在附录A中介绍。 本标准修改采用OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2008版）（ManualofDiagnosticTestsand Vaccines forTerrestrialAnimals)中第2.1.18章。 本标准与OIE第2.1.18章相比，主要技术差异如下： 本标准等同采用OIE规定的病原分离鉴定和试管凝集试验； 一本标准增加了OIE中提及但没有详细操作规程的聚合酶链反应（PCR)和荧光聚合酶链反应 （荧光PCR）的具体试验步骤； 本标准未采纳OIE中提及但没有详细操作规程的免疫荧光（FAT）和酶联免疫吸附试验 (ELISA)。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国山西出入境检验检疫 局、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：唐泰山、高峰、廉慧锋、张吉红、黄素文、方绍庆、张常印、张睿、王凯民、姜焱、 陈国强、祝长青。 SN/T 1501—2015 野兔热检疫技术规范 1范围 本标准规定了野兔热（土拉杆菌病）的临床诊断、土拉杆菌的显微镜检查、细菌培养、聚合酶链反应、 试管凝集试验和动物试验等技术要求。 本标准适用于进出口动物及其产品中野免热的检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1088布氏杆菌检疫技术规范 SN/T1193基因检验实验室技术要求 SN/T2025 动物检疫实验室生物安全操作规范 3生物安全和防污染措施 野免热是农业部规定的二类动物疫病，其病原为土拉杆菌，该菌的大量活菌操作和动物感染试验需 在生物安全3级实验室进行，样本的病原菌分离纯化、生化试验、免疫学试验、PCR的核酸提取、涂片、 验室进行。检验过程的生物安全措施应符合GB19489和SN/T2025，检验过程的基因防污染措施应 符合SN/T1193。 4临床诊断 野免热简介参见附录A，野免热的发病症状与病理变化参见附录B。 5实验室诊断 5.1样品采集 5.1.1对死亡或濒死动物，无菌采取病变器官内外炎性、纤维素性或出血性渗出物、全血及肝、脾、骨 髓、肾、肺、淋巴结等样品。对活动物，采集全血、淋巴结或淋巴液、穿刺液等样品。对动物产品，可采集 内脏组织、淋巴结、骨髓、肉或皮毛等样品。 5.1.2疑似样本的采集需要做好生物安全防护，样品的采集和包装应采用无菌器具，样本采集后应密 封、冷藏并立即用最快的方式运送到实验室。 5.1.3以细菌培养诊断动物感染土拉杆菌时.样品的选择应以观察到的临床症状或检观察到病理变 化为依据，最有用的样品包括肝、脾、骨髓、肾、肺、淋巴结和血液。土拉杆菌在低温条件下存活时间较 SN/T15012015 长，阳光直射、紫外线、60℃高温和常规消毒剂可很快将其杀死，它们在产品不同部位的分布与特殊加 工工艺造成的物理化学条件、包装运输保存条件等有关。 5.1.4严重污染或含菌量少的样本，进行动物接种可提高检出率，但除非绝对必要，尽量避免使用动物 试验。 5.2显微镜检查 5.2.1试剂 3%盐酸酒精、结晶紫染色液、革兰氏碘液、沙黄复染液，配制方法见附录C。 5.2.2主要设备和材料 显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片。 5.2.3试验程序 5.2.3.1涂片制备 肝、脾、骨髓、肾、肺等组织样本压片，渗出液、血液等液体样本直接涂片，细菌培养物直接涂片。 5.2.3.2革兰氏染色 涂片自然干燥后用3%盐酸酒精固定5min.水洗、干燥后作革兰氏染色镜检。 滴加结晶紫染色液，染1min.水洗。滴加革兰氏碘液，作用min水洗。滴加95%乙醇脱色，约 15s～30s.直至染液被洗掉.不要过分脱色.水洗。滴加沙黄复染液，复染1min。水洗，风干，镜检。 5.2.4结果判定 土拉杆菌为革兰氏阴性菌，革羊氏染色后菌体染成红色若发现到革兰氏染色阴性，无芽胞、无鞭 毛、大小0.2um～0.7uμm，以椭圆形为主的多形态球杆菌，可作出似拉杆菌阳性诊断，否者判为显 微镜检查阴性。 5.3 毛细管沉淀试验 5.3.1 试剂和材料 5.3.1.1 除另有规定外.所有试剂均为分析纯或生化试剂。 5.3.1.2生理盐水（配制方法见附录C），乙醚。 5.3.1.3 土拉杆菌标准菌株（由指定单位提供）。 5.3.1.4 土拉杆菌阳性血清（由指定单位提供）。 5.3.1.5 无菌石英砂，无菌研钵，毛细管，无菌玻璃试管。 5.3.2主要设备 微量可调移液器.离心机，37℃恒温箱。 5.3.3试验方法 取脾、肝和骨髓等组织，按照1：3～1：5的量（质量比)加入生理盐水：并加人适量无菌石英砂，在 研钵内充分研磨，然后将组织混悬液转移至无菌玻璃试管中，加入2倍量（体积比)的乙醚，充分振摇，室 温静置4h～5h.再次振摇，室温静置过夜。吸取水相于2000r/min离心30min，取上清100μl，加人 SN/T1501—2015 到预加有100μL土拉杆菌阳性血清的毛细管中，37℃下静置3h后，4℃过夜，观察是否出现沉淀环。 同时用土拉杆菌标准菌株和生理盐水分别做阳性对照和阴性对照。 5.3.4结果判定 结果判定如下： a）土拉杆菌标准菌株的阳性对照出现沉淀环，生理盐水的阴性对照不出现沉淀环，结果成立。 b) 被检样本不出现沉淀环的，判为病理样品毛细管沉淀试验阴性。 c） 被检样本出现沉淀环的，判为病理样品毛细管沉淀试验阳性。可用细菌分离鉴定、PCR或荧 光PCR方法对结果进一步确认。 5.4细菌培养 5.4.1试剂 弗朗西斯培养基、麦康凯和查平氏（McCoyandChapin）培养基、改良Thayer-Marin琼脂、GBCA培 养基，配制方法见附录C。 5.4.2主要设备 显微镜、普通培养箱或二氧化碳培养箱等。 5.4.3样品培养 无菌采取样本，接种于弗朗西斯培养基、McCoyandrChapin培养基、改良Thayer-Marin琼脂或 GBCA培养基，置于普通培养箱或二氧化碳培养箱（5%二氧化碳）37℃培养。污染样本还可采用选择 性培养基，即在胱氨酸心肌琼脂（DIFCO)中加人5%脱纤免血、青霉素至终浓度100U/mL、硫酸多粘 菌素B至终浓度100U/mL、环已酰亚胺（每升培养基中加人1%的贮藏溶液0.1mL）。 注：胱氨酸心肌琼脂（DIFCO)为商品化培养基，也可采用其他等效产品。 5.4.4培养物形态观察 土拉杆菌在弗朗西斯培养基和改良Thayer-Martin琼脂上生长良好，形成粘稠、乳白色、融合的菌 落，在McCoyandChapin培养基上形成细小、凸起圆形的透明菌落， 土拉杆菌在普通培养基上不生长，只有极个别的菌株在初次分离时能在血琼脂上生长，只有在加人 胱氨酸、半胱氨酸血液或卵黄的培养基中生长。样本培养48h后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色 和生化试验。该菌不运动，无芽孢，两极着色，培养24h后菌体形态均匀一致，老龄培养菌则具多形性。 5.4.5结果判定 对具有土拉杆菌形态的菌落进行革兰氏染色，革兰氏染色阴性且细菌形态与土拉杆菌相似的，判定 为土拉杆菌细菌培养疑似阳性。分离细菌进一步用PCR或荧光PCR、凝集试验或动物接种试验鉴定 为阳性的，判定为土拉杆菌细菌分离培养阳性。否者，判定为土拉杆菌细菌分离培养阴性。 分离培养物培养3周后如无可疑菌落生长，判定为土拉杆菌细菌分离培养阴性。 5.5聚合酶链反应（PCR） 5.5.1试剂 5.5.1.1除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 5.5.1.2实验用水（应符合GB/T6682中一级水的规格），Taq酶，PCR缓冲液（与Taq酶匹配），氯化 3