SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1226—2015 代替SN/T1226—2:003 SN/T 1557-2:005 禽痘检疫技术规范 Quarantine protocol for fowlpox 2015-02-09发布 2015-09-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1226—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准主要依据是OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2012)第2.3.10章节《禽痘》。 本标准代替SN/T1226--2003《禽痘抗体检测方法红细胞凝集抑制试验》和SN/T1557-20C15 《禽痘琼脂免疫扩散试验操作规程》。 本标准与SN/T1226—2003和SN/T1557—2005相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下： 增加了禽痘病毒分离及鉴定； 增加了抹片镜检； 一增加了荧光抗体试验； -增加了聚合酶链式反应。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：林庆燕、曾少灵、陶虹、孙洁、秦智锋、唐金明、阮周曦、廖立珊、刘建利、卢体康、 陈书琨、陈兵、胡运发。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1226—2003; SN/T1557-2005。 1 SN/T1226—2015 见附录A）、碘酒或75%酒精、MEM培养基、胎牛血清、抗生素储备液（青霉素10000IU/mL，链霉素 10000μg/ml，可直接购买商业抗生素浓缩液）。 4.2.2样品采集与制备 用剪刀与镊子插入病变组织内，采集新出现的病变组织2.0g以上，放入研钵中充分研磨，加5ml， pH7.20.01mol/1.PBS溶液（含青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL）混匀，将组织悬液转入无菌 10mL离心管中，以3000r/min离心10min，吸取上清液转人无菌1.5mL离心管中，编号备用。样品 应尽快处理，可在4℃保存4d.如要保存更长时间，需保存于80℃条件下。 4.2.3鸡胚分离 4.2.3.1选择9d～12d的SPF鸡胚，用5%石碳酸进行表面消毒。 4.2.3.2在照蛋器上观察，选择鸡胚血管较少的一侧，用电烙铁在卵壳上烙-个烤焦圈，或用自制针头 （无针尖）沿定位线钻一个直径5mm的圆圈.但不能钻透壳膜。用刀片挑起一小片卵壳。另外，在气室 上方用针头钻穿一个孔。 4.2.3.4从侧面的开口，用注射器通过壳膜插入约5mm深，将0.1mL的样品滴在下陷的绒毛尿囊膜 上。缓慢抽出针头，用胶带将蛋壳上的两个孔全部封住。将气室端向上，鸡胚于37℃孵化箱内孵育（见 图 1)。 8 人工气室 吸气 图1尿囊膜接种法 4.2.3.5每日观察接种的鸡胚，弃掉24h内死亡的鸡胚。 4.2.3.6第6d～7d后，打开蛋壳，观察鸡胚的绒毛尿囊膜上是否发生水肿增厚，或者是否产生了呈局 灶性或弥漫性分布、致密、坚实的增生性白色痘斑，记录鸡胚绒毛尿囊膜上的病变情况。 4.2.3.7绒毛尿囊膜的收取：将鸡胚放于卵架上，用碘酒和酒精消毒表面。从气室端剥去卵壳，用镊子 夹住绒毛尿囊膜（或先将鸡胚倾人平Ⅲ中，再用镊子夹住绒毛尿囊膜），加人几滴PBS溶液，置于暗色平 面上，以便计数痘斑或病斑。按4.3进行抹片镜检和结果判定。 4.2.4细胞分离 4.2.4.1 可以选择原代鸡胚成纤维细胞、鸡胚肾细胞、鸡胚皮肤细胞或鸭胚细胞进行禽痘病毒的繁殖。 4.2.4.2待细胞长成良好单层后，吸出原培养液，每瓶接人按4.2.2处理好的样本0.5mL。 4.2.4.3 置37℃培养箱中吸附1h后，加人37℃预温的新培养液5mL，置CO2培养箱中继续培养，逐 日观察细胞病变情况（CPE），拍摄细胞病变影像，记录结果。 4.2.4.4结果判定：禽痘病毒接种鸡胚成纤维细胞，一般在接种第4d～6d可产生细胞病变，如细胞出 现变圆、折光性增强等症状，第8d9d细胞发生变形，完全被破坏。某些病毒株在鸡胚成纤维细胞单 2 SN/T1226—2015 层培养物中能形成具有明显特征的蚀斑，大小约2mm～9mm，中央透明而四周不太透明，类似病毒在 鸡胚绒毛尿囊膜上形成痘斑而呈现的环状带。但不是所有的毒株都能在细胞培养层中产生蚀斑，通常 适应细胞的毒株才能产生蚀斑。 4.3抹片镜检 4.3.1试剂和材料 病禽的皮肤或白喉病变组织，初染剂、0.8%孔雀绿复染剂（配制方法见附录A）。 4.3.2操作步骤 4.3.2.1在载玻片上加1滴蒸馏水和少许皮肤或白喉病变组织，用另一载玻片将组织压成薄涂片，并将 上层载玻片转动数次。 4.3.2.2 2自然干燥后，在火焰上将涂片轻微固定。 4.3.2.3 涂片用新配制的初染剂染色5min～10min。 4.3.2.4以自来水冲洗玻片。 4.3.2.5以复染剂复染30s～60s。 4.3.2.6 6以自来水冲洗玻片，干燥。 4.3.2.7 油镜下观察涂片。 4.3.2.8 结果判定：如在镜下观察到0.2μm～0.3μm的呈红色的禽痘病毒原生小体，可判定病禽感染 了禽痘病毒。 4.4琼脂免疫扩散试验（AGID） 4.4.1i 设备、材料和试剂 平皿（直径为90mm）、塑料吸头、打孔器（7孔梅花样金属打孔器：内孔4.0mm，孔间距3.0mm）， 琼脂免疫扩散试验专用的禽痘标准阳性抗原、禽痘标准阳性血清、琼脂糖、氯化钠（NaC1)，pH7.2的 0.01mol/LPBS溶液、1%硫柳汞溶液（配制方法见附录A）。 4.4.2操作步骤 4.4.2.1琼脂板的制备 4.4.2.1.1称取琼脂糖1.0g，加人pH7.2的0.01mol/LPBS溶液至100mL。 4.4.2.1.2 加热融化后，加人8.0gNaC1，充分溶解后，加人1.0mL1%硫柳汞溶液（终浓度为0.01%）。 4.4.2.1.3 3冷却至45℃～50℃，将洁净干燥、直径为90mm的灭菌平皿，放置在水平平台上，每个平皿 加18mL，厚度约为3.0mm。 4.4.2.1.4胶凝固后盖严，把平皿倒置放人4℃冰箱中保存备用。 4.4.2.2打孔 反应孔现用现打。从冰箱中取出琼脂板，用7孔一组的梅花形打孔器进行打孔（见图2），孔径4.0mm，孔 距3.0mm。将孔中的琼脂糖轻轻挑出或吸出，注意不要被坏孔边缘或使琼脂层脱离玻璃。平皿中各孔 排列见图3。