ICS13.300 CCSA80 中华人民共和国国家标准 GB/T21786—2025 代替GB/T21786—2008 化学品 细菌回复突变试验方法 Chemicals—Testmethodofbacterialreversemutation 2025-08-29发布 2025-12-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T21786—2008《化学品 细菌回复突变试验方法》,与GB/T21786—2008相 比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a) 更改了“细菌”的内容(见5.1.1.4,2008年版的4.1.1.4); b) 更改了“染毒剂量”的内容(见5.2.2.1,2008年版的4.2.2.1); c) 更改了“对照”的内容(见5.2.3.3,2008年版的4.2.3.3); d) 更改了“试验步骤”的内容(见5.3.1、5.3.2,2008年版的4.3.1.1、4.3.1.2)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。 本文件起草单位:中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所、中国疾病预防控制中心环境与健 康相关产品安全所、平顶山市慧鑫源生物科技有限公司。 本文件主要起草人:沈美丽、戴宇飞、段化伟、陈圆圆、邓富昌、石莹、张少平、刘帅、石东东。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———2008年首次发布为GB/T21786—2008; ———本次为第一次修订。 ⅠGB/T21786—2025 引 言 细菌回复突变试验是利用营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和大肠杆菌 (Escherichiacoli)菌株来检测基因突变,突变涉及DNA的一个或多个碱基对的置换、插入或缺失。本 试验的原理是检测受试物导致试验菌株因回复突变进而恢复合成必需氨基酸的能力。发生回复突变的 细菌能在缺乏特定必需氨基酸的条件下生长,而亲代菌株则不能生长,故可根据菌落形成数量,判断受 试物是否为致突变物。 基因突变是导致众多遗传性疾病的关键因素,且有充分证据表明,体细胞癌基因和抑癌基因的突变 与人类和实验动物的肿瘤形成有关。细菌回复突变试验具有快速、经济和操作相对简便等优点。试验 菌株还具有某些特征,使其对突变检测更加敏感,例如回复突变位点存在响应性DNA序列,细菌对大 分子物质的通透性增强,以及DNA修复系统缺陷或DNA易错修复过程增强。试验菌株的特异性可为 遗传毒物诱发的突变类型提供有价值的研究信息。现已构建了包含多种化学结构物质的细菌回复突变 试验结果的数据库,可从中获取相关资料。同时,还为不同理化性质的化学品建立了完善的测试方 法,包括挥发性化合物。 细菌回复突变试验采用的是原核细胞,其在吸收、代谢、染色体结构和DNA修复过程等方面与哺 乳动物细胞存在显著差异。本试验属于体外试验,可加入外源性代谢活化系统,但外源性代谢活化系统 不能完全模拟体内代谢条件。因此,本试验结果不能为受试物对哺乳动物的致突变和致癌能力提供直 接证据。 细菌回复突变试验可用于遗传毒性的初步筛选,尤其适用于检测受试物诱发的点突变。大量研究 数据表明,许多在本试验中呈阳性的化学品在其他试验中也显示出致突变性,但也有一些致突变剂在本 试验中未能检出。这种局限性可能与检测终点的特殊性质、代谢活化的差异或生物利用度的差异有关。 另外,提高本试验灵敏度的因素可能会高估受试物的致突变活性。 细菌回复突变试验不适用于评估某些类别的化学品,例如具有较强杀菌作用的化合物(如某些抗生 素)和特异性干扰哺乳动物细胞复制系统的化合物(如某些拓扑异构酶抑制剂和某些核苷类似物)。对 这些受试物,哺乳动物细胞致突变试验可能更适用。 虽然许多在本试验中呈阳性的化合物都是哺乳动物的致癌物,但其相关性并不是绝对的,而是与化 学品的类别有关。有一些致癌物通过非遗传毒性机制或试验菌株缺乏的机制诱发癌症,所以不能在本 试验中检出。 ⅡGB/T21786—2025 化学品 细菌回复突变试验方法 1 范围 本文件给出了细菌回复突变试验方法的试验基本原则,规定了试验方法、试验数据和报告。 本文件适用于检测化学品(有杀菌作用的除外)的致突变性。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 回复突变试验 reversemutationtest 以营养缺陷型的突变体菌株为指示生物,进行基因突变检测的体外试验。 注:常用的菌株有组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和色氨酸营养缺陷型大肠杆菌 (Escherichiacoli)。 4 试验基本原则 4.1 细菌悬液分别在加入和不加入外源性代谢活化系统的条件下,与受试物混匀。在平板掺入法 中,将上述混合物与顶层琼脂充分混匀,再迅速倾入底层琼脂平板上。在预培养法中,先将细菌悬液与 受试物混合进行预培养,然后与顶层琼脂充分混匀,再迅速倾入底层琼脂平板上。上述平板培养2d~3d 后,计数回变菌落数,并与溶剂对照组的自发回变菌落数进行比较。 4.2 细菌回复突变试验有多种操作方法,其中最常用的是平板掺入法、预培养法、波动法和悬浮培养 法。此外,还有用于检测气体或蒸气的改良方法。 4.3 本文件所描述的主要是平板掺入法和预培养法。这两种方法在加入和不加入代谢活化系统的条 件下都能进行。有些化学品宜使用预培养法,包括短链脂肪族亚硝胺、二价金属、醛类、偶氮染料和重氮 化合物、吡咯里西啶生物碱、烯丙基化合物以及硝基化合物。某些类别的化学品用标准方法(例如平板 掺入法和预培养法)有时不能检出阳性结果。对这些特殊样品应采用替代方法进行检测。对偶氮染料 和重氮化合物、气体和挥发性化学品以及糖苷类等特殊样品的检测,已有文献报道过替代方法。对标准 方法的偏离应有科学依据。 5 试验方法 5.1 试验准备 5.1.1 细菌 5.1.1.1 新鲜菌悬液应培养至对数生长期晚期或稳定期早期(浓度约为每毫升109个),不应使用稳定 1GB/T21786—2025 期晚期的菌悬液。试验采用的菌悬液应含有较高浓度的活细菌。活菌浓度可通过细菌生长曲线的历史 对照数据确定,或每次试验时通过平板计数法测定。 5.1.1.2 宜采用的培养温度为37℃。 5.1.1.3 至少应使用5种菌株。宜使用的菌株组合方案如下: a) 鼠伤寒沙门氏菌TA1535; b) 鼠伤寒沙门氏菌TA1537或TA97或TA97a; c) 鼠伤寒沙门氏菌TA98; d) 鼠伤寒沙门氏菌TA100; e) 大肠杆菌WP2uvrA或大肠杆菌WP2uvrA(pKM101)或鼠伤寒沙门氏菌TA102。 注:所使用的鼠伤寒沙门氏菌(TA1535;TA1537或TA97或TA97a;TA98和TA100)在不同实验室间的检测结果 可靠且具有重现性。这些菌株在回复突变位点含有GC碱基对,已知其可能无法检测某些氧化性诱变剂、交联 剂和肼类化合物。此类物质能通过大肠杆菌WP2系列或鼠伤寒沙门氏菌TA102进行检测,这些菌株在回复 突变位点含有AT碱基对。检测交联剂时,能采用鼠伤寒沙门氏菌TA102,或使用DNA修复功能完整的大肠 杆菌,例如大肠杆菌WP2或大肠杆菌WP2(pKM101)。 5.1.1.4 应按照已建立的标准操作规程,对菌种进行培养、鉴定和保存。每次复苏冻存菌种的培养制品 时,应进行氨基酸需求试验。此外,还应进行其他鉴定,包括是否存在R因子和特征性突变。试验菌株 会产生自发回变,通过平板计数获得的自发回变数应在实验室历史对照数据范围内或文献报道的范 围内。 注:氨基酸需求试验,即鼠伤寒沙门氏菌需要组氨酸,大肠杆菌需要色氨酸。R因子鉴定,例如TA97、TA97a、 TA98、TA100和WP2uvrA(pKM101)菌株对氨苄青霉素的抗性,以及TA102菌株对氨苄青霉素和四环素的 抗性。特征性突变,例如鼠伤寒沙门氏菌的rfa突变使其对结晶紫敏感,大肠杆菌的uvrA突变或鼠伤寒沙门 氏菌的uvrB突变使其对紫外线敏感。 5.1.2 培养基 应用适宜的底层琼脂培养基(例如含Vogel-Bonner培养基E和葡萄糖)和含有组氨酸与生物素(或 色氨酸)的顶层琼脂,以供细菌完成少量细胞分裂。 5.1.3 代谢活化 应在有和无适量代谢活化系统的两种条件下对受试物进行检测。应根据受试物的类别选择代谢活 化系统及其应用条件。最常用的代谢活化系统是S9。S9是由多氯联苯(Aroclor1254)诱导或苯巴比 妥和β-萘黄酮联合诱导的啮齿类动物肝脏制备而成。常用的S9混合物中S9的浓度范围是5%~30% (体积分数)。若适用,可使用一种以上浓度的S9。对于偶氮染料和重氮化合物,应采用还原性代谢活 化系统。 5.1.4 受试物准备 试验前,固体受试物应溶解或混悬于适宜的溶剂/赋形剂中,若需要可适当稀释。液体受试物可直 接加入测定体系和/或在处理前适当稀释。若缺乏资料证明受试物储存具有稳定性,受试物应现用 现配。 5.2 试验条件 5.2.1 溶剂/赋形剂 溶剂/赋形剂不应与受试物发生化学反应,且应对细菌的存活和S9的活性无影响。若采用的不是 常用的溶剂/赋形剂,应有资料提供适合的理由。试验中宜首选水性溶剂/赋形剂。若受试物对水不稳 2GB/T21786—2025