ICS 65.020.20 CCS B 16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5930—2025 2025 ‑07‑25发布 2026 ‑02‑01实施番茄顶缩类病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of pospiviroid apicimpeditum 中华人民共和国海关总署 　　发　 布SN/T 5930—2025 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 ：中华人民共和国兰州海关 、中华人民共和国湛江海关 、中华人民共和国大连海关 。 本文件主要起草人 ：文朝慧、王军平、卢乃会、王溪桥、尤佳、李春雷、刘志业、王秀芬。 ⅠSN/T 5930—2025 番茄顶缩类病毒检疫鉴定方法 1 范围 本文件描述了番茄顶缩类病毒 RT‑PCR 和实时荧光 RT‑PCR 检疫鉴定方法 。 本文件适用于番茄 、辣椒等茄科植物材料 ，包括种子 、种苗及其果实携带的番茄顶缩类病毒的检疫 鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 SN/T 2122　进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 4 番茄顶缩类病毒基本信息 中文名：番茄顶缩类病毒 。 学名：Pospiviroid apicimpeditum 。 英文名：Tomato apical stunt viroid 。 缩写：TASVd。 分类地位 ：马铃薯纺锤形块茎类病毒科 Pospiviroidae 、马铃薯纺锤形块茎类病毒属 Pospiviroid 。 番茄顶缩类病毒的寄主范围 、传播途径 、基因组特征等基本信息见附录 A。 5 方法原理 番茄顶缩类病毒基因组特征是检测鉴定该类病毒的主要依据 。采用反转录聚合酶链式反应 RT‑PCR 和实时荧光 RT‑PCR 方法特异性检测鉴定该类病毒 。 6 仪器、设施、用具和试剂 6.1 仪器设备 实时荧光 PCR仪、PCR仪、电子天平 、电泳仪、凝胶成像系统 、水浴锅、冷冻离心机 、-80 ℃超低温冰 箱、高压灭菌锅 、微波炉、漩涡振荡器 、研磨仪、移液器。 6.2 试剂 植物总 RNA提取试剂盒 、一步法 RT‑PCR 检测试剂盒 、一步法实时荧光 RT‑PCR 检测试剂盒 、琼脂 1SN/T 5930—2025 糖、样品提取缓冲液等 。分子生物学试剂配制按附录 B。除有特殊说明外 ，所有试验用试剂均为分析纯 。 注： 等效商品化试剂同等使用 。 7 抽样和样品制备 7.1 抽样 抽样按照 SN/T 2122的规定执行 。 7.2 制样 7.2.1 种子类样品 若样品中存在畸形 、不成熟的种子 ，则从中挑取出来单独作为一个样品进行检测 ；若无明显异常 ，则 随机取适量种子 ，研磨器研磨成粉后 ，按照 1∶5~1∶10（W/V）加入抽提缓冲液 （见B.1.2）混合均匀 ，3 000g 低速离心 5 min后取 100 μL上清液用于核酸检测 ，或适量种子液氮研磨干粉后取 0.1 g提取 RNA。 注： 有特殊制样要求如出口欧盟的茄科种子 ，按照要求制备待检样品 。 7.2.2 植株类样品 对于有症状的种苗类样品单独检测 ，重点选取表现症状的幼嫩叶片 ；无症状样品至少选取 20株的幼 嫩叶片进行混样检测 。样品研磨后按照 1∶5~1∶10（W/V）加入提取缓冲液混合均匀 ，制备的汁液分别盛 装于 1.5 mL离心管中 ，3 000g低速离心 5 min后吸取上清液用于核酸检测 ；或直接将叶片或果实等进行 研磨，取约 0.1 g样品提取 RNA。 8 检测 8.1 RT‑PCR 检测 取7.2中制备的样品 ，提取总 RNA或总核酸 ，然后进行 RT‑PCR 检测，并设置阳性对照 、阴性对照 、 空白对照 ，具体检测步骤见附录 B。 8.2 实时荧光 RT‑PCR 检测 取7.2中制备的样品 ，提取总 RNA或总核酸 ，然后进行实时荧光 RT‑PCR 检测，并设置阳性对照 、 阴性对照 、空白对照 ，具体检测步骤 按附录 C。 9 结果判定 样品经 RT‑PCR 检测或实时荧光 RT‑PCR 检测为阴性 ，判定该样品不携带目标类病毒 。 样品经 RT‑PCR 和实时荧光 RT‑PCR 检测均为阳性 ，或经 RT‑PCR 检测呈阳性且序列测定比对结果 与目标类病毒具有高度同源性时 ，判定该样品携带 TASVd。必要时，可通过生物接种等方法进一步鉴定 。 10 样品与记录结果保存 10.1 样品保存 对检出 TASVd 的样品应妥善保存 ，以备复核 ，如涉及到贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕 。该类 2SN/T 5930—2025 样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理 。 10.2 记录结果保存 实验室应保存完整的试 验记录及相关结果图片 。 3SN/T 5930—2025 附 录 A （资料性 ） 番茄顶缩类病毒基本信息 A.1 寄主范围 TASVd 寄主有番茄 （Solanum lycopersicum ） 、辣椒（Capsicum annuum ） 、扭管花（Streptosolen jameso ⁃ nii） 、素馨叶白英 （Solanum laxum ） 、蓝花茄（Lycianthes rantonnetii ） 、夜香树属 （Cestrum sp.）和曼陀罗木属 （Brugmansia sp.）等植物。 A.2 为害症状 TASVd 在番茄上的症状包括叶片卷曲 、植株顶端发育不良 、严重矮化 ，产生坏死病斑 ，叶片畸形 、叶 脉黄化、变脆，果实变小等 （图A.1） 。受TASVd 侵染的观赏植物不表现症状 。 　 图A.1　TASVd侵染番茄的症状 （引自 https：//gb.eppo .int） A.3 地理分布 欧洲：比利时、克罗地亚 、德国、意大利、荷兰、波兰、斯洛文尼亚 。 非洲：科特迪瓦 、加纳、塞内加尔 、突尼斯。 亚洲：印度尼西亚 、以色列。 A.4 传播方式 TASVd 易通过机械接种传播 ，能通过种子 、花粉、熊蜂（Bombus terrestris ）传播，Antignus（2007）等报 道在番茄 （品种 Hazera 189）中种传率高达 80%。 A.5 基因组特性 TASVd 为单链环状 RNA，大小为 360 nts~ 364 nts，推测具有广泛碱基配对特征的棒状结构 （图A.2） 。 图A.2　TASVd核苷酸序列及其二级结构 （引自 Kiefer et al .，1983） 4SN/T 5930—2025 附 录 B （规范性） RT‑PCR 检测 B.1 试剂 B.1.1 10×PBST 缓冲液（pH 7.4） 氯化钠（NaCl）80.0 g，磷酸氢二钠 （Na 2HPO 4）11.5 g，磷酸二氢钾 （KH 2PO 4）2.0 g，氯化钾（KCl）2.0 g， 吐温 ‑20（Tween‑ 20）5 mL，加入 900 mL水溶解，用氢氧化钠 （NaOH）或盐酸（HCl）调节 pH至7.4，然后补 水至 1 L。 注： 也能购买配制好的浓缩液或干粉制剂 ，稀释使用 。 B.1.2 样品抽提缓冲液 （pH 7.4） 10×PBST 100 mL，亚硫酸钠 （Na 2SO 3）1.3 g，聚乙烯吡咯烷酮 （PVP） （MW 24 000~40 000）20.0 g， 加入 800 mL水溶解，用氢氧化钠 （NaOH）或盐酸（HCl）调节 pH至7.4，然后补水至 1 L，4 ℃储存。 注： 也能购买配制好的浓缩液或干粉制剂 ，稀释使用 。 B.1.3 核酸提取试剂 Trizol裂解液，三氯甲烷 ，异丙醇，75%乙醇或直接购买商品化核酸提取试剂盒 。 B.1.4 RT‑PCR 检测试剂 一步法 RT‑PCR 检测试剂盒 。 B.1.5 电泳缓冲液 TAE（ 50×） 三羟甲基氨基甲烷 （Tris）242 g，冰醋酸（C2H4O2）52.1 mL，乙二胺四乙酸二钠 （Na 2EDTA·2H2O） 37.2 g，加水定容至 1 L。使用时加水稀释至 1×TAE。 注： 也能购买配制好的浓缩液或干粉制剂 ，稀释使用 。 B.1.6 引物序列 RT‑PCR 检测引物见表 B.1。 表B.1　一步法 RT‑PCR 检测引物 引物名称 上游引物 TASVd FOB 下游引物 TASVd ROB引物序列 （5′→3′） GCTTCTCTCTGGAGACTACCCGGT TCCGGGCGAGGGCCGAAGACCT片段大小 ~364 bp 5SN/T 5930—2025 B.2 试验步骤 B.2.1 总RNA提取 使用 Trizol法提取总 RNA。取7.2中制备的样品上清液 100 μL或0.1 g粉末移入灭菌的 1.5 mL离心 管中，加入 1 mL Trizol 试剂，剧烈振荡摇匀 3 min；4 ℃，12 000g离心 10 min；取上清液 ，加入 0.2 mL三氯 甲烷，上下颠倒混匀 ，室温静置 3 min；4 ℃，12 000g离心 10 min；取上层水相 ，加等体积的异丙醇 ，颠倒混 匀；4 ℃，12 000g离心 10 m