中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 传染性造血器官坏死病检疫技术规范 Quarantine technical specification for infectious haematopoietic necrosis 中华人民 共和国海关总署 　　发　 布ICS 11.220 CCS B 41 SN/T 1474—2025 代替 SN/T 1474—2014 2025 ‑07‑25发布 2026 ‑02‑01实施SN/T 1474—2025 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 本文件代替 SN/T 1474 —2014《传染性造血器官坏死病检疫技术规范 》 ，与SN/T 1474 —2014相比， 除结构调整和编辑性改动外 ，主要技术变化如下 ： a）增加了在 “采样和制样 ”章节中样品保存及运送 （见第 8章） ； b）更改了 RT‑PCR 方法为套式 RT‑PCR 检测（见9.2，2014年版的 9.2） ； c）增加了“实时荧光 RT‑PCR ”检测方法 （见9.3）； d）增加了“实时荧光 RT‑RAA ”检测方法 （见9.4）； e）删除了“中和试验 ”检测方法 （见2014年版的 9.4）； f）更改了“综合判定 ” （见第 10章，2014年版的第 10章） 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 ：中华人民共和国深圳海关 、深圳市检验检疫科学研究院 、广东大百汇海洋科技集团 有限公司 、深圳技术大学 、中华人民共和国青岛海关 、中华人民共和国沈阳海关 。 本文件主要起草人 ：温智清、郑晓聪、朱崧琪、刘荭、贾鹏、岳志芹、尹伟力、廖立珊、孙洁、耿庆华、吴江、 王津津、朱裕敏。 本文件及其所替代文件的历次版本发布情况为 ： ——2004年首次发布为 SN/T 1474 —2004； ——2014年第一次修订为 SN/T 1474 —2014； ——本次为第二次修订 。 ⅠSN/T 1474—2025 传染性造血器官坏死病检疫技术规范 1 范围 本文件描述了传染性造血器官坏死病的病毒分离 、套式 RT‑PCR 、实时荧光 RT‑PCR 、实时荧光 RT‑RAA 、酶联免疫吸附试验 、间接免疫荧光试验检测方法和综合判定方法 。 本文件适用于传染性造血器官坏死病的诊断 、检疫和监测 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088　出入境动物检疫采样 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 CPE：细胞病变效应 （Cytopathic effect ） Ct：循环阈值 （Cycle threshold ） dNTPs：三磷酸脱氧核苷酸 （Deoxynucleotide triphosphates ） DEPC：焦碳酸二乙酯 （Diethypyrocarbonate ） EPC：鲤鱼上皮瘤细胞系 （Epithelioma Papulosum cyprini ） EDTA：乙二胺四乙酸 （Ethylenediaminetetraacetic acid ） ELISA：酶联免疫吸附试验 （Enzyme‑linked immunosorbent assay ） FBS：胎牛血清 （Fetal bovine serum ） FHM：肥头鲤细胞系 （Fathead minnow ） FITC：异硫氰酸荧光素 （Fluorescein isothiocyanate ） HEPES：4‑羟乙基哌嗪乙磺酸 ［4‑（2‑hydroxyethyl ）‑1‑piperazineethanesulfonic acid ］ HRP：辣根过氧化物酶 （Horseradish peroxidase ） IHN：传染性造血器官坏死病 （见附录 A） （Infectious haematopoietic necrosis ） IHNV：传染性造血器官坏死病毒 （Infectious haematopoietic necrosis virus ） IPNV：传染性胰脏坏死病毒 （Infectious pancreas necrosis virus ） RNA：核糖核酸 （Ribonucleic acid ） RT‑PCR ：逆转录聚合酶链式反应 （Reverse transcription polymerase chain reaction ） 1SN/T 1474—2025 RT‑RAA ：逆转录重组酶介导链替换核酸扩增 （Reverse transcription‑recombinase‑aid amplification ） T值：阈值时间 （Time threshold ） 5 仪器和设备 5.1 24孔、96孔细胞培养板 、细胞培养瓶 。 5.2 组织研磨器或无菌研钵 。 5.3 恒温培养箱 （15 ℃、25 ℃） 。 5.4 倒置荧光显微镜 。 5.5 PCR扩增仪。 5.6 实时荧光 PCR仪。 5.7 恒温荧光检测仪 。 5.8 水平电泳仪 。 5.9 凝胶成像仪 。 5.10 酶标仪（450 nm） 。 5.11 普通冰箱和 -80 ℃冰箱。 5.12 低温冷冻离心机 （12 000 r/min） 。 5.13 微量移液器 （0.5 µL、2 µL、100 µL、1 000 µL） 。 6 试剂和材料 6.1 水：符合 GB/T 6682中一级水的规格 。 6.2 DEPC水：配制方法按附录 B中B.1或购买商品化试剂 。 6.3 IHNV参考株：保藏号 ch20101008 。 6.4 鱼类细胞系 ：EPC、FHM。 6.5 细胞培养液 1：按B.2。 6.6 细胞培养液 2：按B.3。 6.7 胰蛋白酶 ‑EDTA 消化液：按B.4。 6.8 Taq DNA聚合酶：-20 ℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化 。 6.9 dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmol/L 。 6.10 RNA酶抑制剂 ：-20 ℃保存，避免温度剧烈变化 。 6.11 AMV逆转录酶 ：-20 ℃保存，避免温度剧烈变化 。 6.12 套式 RT‑PCR 用引物，浓度为 20 μmol/L，序列如下 。 第一轮 PCR引物序列 ： IHNV F 1：5′‑AGAGATCCCTACACCAGAGAC‑ 3′ IHNV R 1：5′‑GGTGGTGTTGTTTCCGTGCAA‑ 3′ 扩增 IHNV糖蛋白基因中大小为 693 bp的片段。 第二轮 PCR引物序列 ： IHNV F 2：5′‑TCACCCTGCCAGACTCATTGG‑ 3′ IHNV R 2：5′‑ATAGATGGAGCCTTTGTGCAT‑ 3′ 扩增 IHNV糖蛋白基因中大小为 483 bp的片段。 6.13 实时荧光 RT‑PCR 用引物和探针 ，浓度为 20 μmol/L，检测 IHNV核蛋白基因片段 ，序列如下 。 IHNV N 796F：5′‑AGAGCCAAGGCACTGTGCG‑ 3′ 2SN/T 1474—2025 IHNV N 875R：5′‑TTCTTTGCGGCTTGGTTGA‑ 3′ IHNV N 818T：5′‑FAM‑TGAGACTGAGCGGGACA‑NFQ/MGB‑ 3′ 6.14 实时荧光 RT‑RAA 用引物和探针 ，浓度为 10 μmol/L，检测 IHNV糖蛋白基因片段 ，序列如下 。 IHNV‑RAA F ：5′‑TATCTRGACGATCTKGTGAAGGCCTC‑ 3′ IHNV‑RAA R ：5′‑CACAGCGACCGTCATGCACATCCCGT‑ 3′ 探针：5′‑TATCAACAAACAGTGTGACTCCATACC ［FAM‑dT ］C［THF］C［BHQ‑dT ］ATCY ‑ AARTTCCG （C3 spacer）‑3′ 6.15 无水乙醇 ：分析纯，使用前预冷至 -20 ℃。 6.16 TAE缓冲液：按B.5。 6.17 PBS：按B.6。 6.18 PBST：按B.7。 6.19 封闭液：按B.8。 6.20 固定液：按B.9。 6.21 抗体：抗IPNV血清、抗IHNV血清和单克隆抗体 。 6.22 HRP标记的抗鼠或抗兔抗体 。 7 临床诊断 病鱼通常表现为游动迟缓 ，呆滞不动和避开水流 ；也有的鱼表现为螺旋游泳 、狂暴乱窜 、打转等活动 异常现象 。皮肤发暗 ，眼球突出 ，鳃丝苍白 ，腹部膨胀 ，鳍基充血 ，不透明的黏液状管状粪便悬挂于肛门 。 传染性造血器官坏死病的流行病学特征见附录 A。 8 样品采集及处理 8.1 采样 样品需采集活的 、发病的、濒死的鱼和鱼卵 ，采样数量按照 GB/T 18088的规定执行 。采样时应避免 采集肝脏和胃肠 。体长小于 4 cm的鱼苗取整条 ；体长 4 cm~ 6 cm的鱼苗取肾脏在内的所有内脏 ；体长 大于 6 cm的鱼取脑 、脾和肾，成熟雌鱼还需取其卵巢液 ；鱼卵仅取卵膜 。 8.2 样品运送及保存 样品运送过程需充氧以保持鱼类的存活 ，尽快送到实验室 ；取鱼的组织需加入含有 10%胎牛血清