SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T34642012 鸭病毒性肝炎I型检疫技术规范 Quarantine protocol for duckviral hepatitis serotype I 2012-12-12发布 2013-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3464—2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准修改采用了OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册2010版2.3.8.B中的诊断技术部分内容， 涵盖了病毒分离与鉴定、PCR方法及中和试验，增加了荧光PCR方法。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫 局、中华人民共和国惠州出人境检验检疫局、吉林农业大学。 本标准主要起草人：王伟利、宋战昀、姜焱、李影、孟庆峰、肖成蕊、周宇、孟日增、刘阳、刘和平、 吴连鹏、石建平，王振国。 I SN/T 3464—2012 鸭病毒性肝炎I型检疫技术规范 1范围 本标准规定了鸭病毒性肝炎I型检疫技术规范，包括病毒分离与鉴定、PCR及荧光PCR方法、血 清中和试验等诊断技术。 本标准适用于进出境鸭病毒性肝炎1型的检疫、疫情监测和流行病学调查。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是往日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DVH:鸭病毒性肝炎 DHVI：鸭病毒性肝炎I型病毒 DEL：鸭胚肝细胞 DEK：鸭胚肾细胞 FCS:胎牛血清 4 临床诊断 4.1发病症状 鸭病毒性肝炎I型（duckviralhepatitisSerotypeI，DHI）是由鸭病毒性肝炎病毒I型（DHV I）引起的维鸭的一种急性高度致死性传染疯，主要侵害4周龄以内的维鸭，特别是不足1周龄的雏鸭 最易感染，死亡率可达90%以上。感染初期病鸭精神菱靡、缩颈、翅下垂、呆滞、共济失调；食欲减退，厌 食；半天至一天后，身体失去平衡歪向一侧，发生全身性抽描，两腿挛式划动。死时头向后仰，呈脚弓 反张姿势。最急性病鸭，常未见任何异常，而突然抽搐挛死亡。病程短.可在1d～2d内死亡。-个 鸭群感染3d～4d后可以全部死亡，但大多数在第二天死亡。 4.2病理变化 剖检可见病变主要发生在肝脏，肝脏肿大、有点状或斑状出血，也有可能伴有明显的脾脏肿大、肾肿 胀和肾血管充血。肝脏显微病变的特点是肝细胞广泛坏死和胆管增生，不同程度的细胞炎性反应和 出血。 4.3流行病学 该病一年四季均可发生。病鸭及隐性带毒成鸭是主要的传染源。在自然界条件下，本病只发生于 1 SN/T3464—2012 维鸭，维鹅亦可感染。主要是4周龄内的雏鸭发病，成鸭呈隐性感染，目前，发病日龄有增大趋势。该病 多与沙门氏菌、大肠杆菌、曲霉菌、鸭疫里默氏杆菌、鸭霍乱等混合或继发感染。本病通过消化道和呼吸 道感染，无垂直传播。母源抗体的高低是本病发生的主要因索，饲养管理不良，缺乏维生索和矿物质，鸭 舍潮湿、拥挤，均可促使本病的发生。康复鸭仍然可从粪便中排毒，粪便对环境污染，在鸭病毒性肝炎的 传播中起重要作用。 近年来临床上在较大日龄鸭群或已作免疫接种的鸭群发生本病时，病例常缺乏典型的病理变化，仅 见肝脏稍肿大、淤血，表面有末梢毛细血管扩张破裂而无严重的斑点状出血，易造成误诊、渐诊，必须经 过病原分离鉴定确诊。 5病毒分离与鉴定 5.1仪器、材料与试剂 5.1.1仪器 生物安全柜、高速冷冻离心机、研钵、孵化箱、组织匀浆器。 5.1.2材料 射器（1mL，5mL）、细胞培养瓶、微孔滤膜（0.22μm）、手术剪刀和手术镀子。 5.1.3试剂 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682分析实验室用水规格。 生理盐水、青霉素、链霉素、Hank's平衡盐溶液、Hank's无钙镁平衡盐溶液、抗菌素溶液、胰酶消 化液、细胞培养液、维持液、琼脂维持液、稀释液、细胞生长液（见A.1～A.10）、新生特牛血清。 5.2实验动物 5.3病料采集与处理 无菌采集的病鸭肝脏用灭菌生理盐水制成20%的匀浆，3000r/min离心30min，取上清液经 0.22μm微孔滤膜过滤，加人抗菌素至终浓度为青霉素20001U/mL，链霍素2000μg/mL，作为待检 样品备用。 5.4病毒分离试验 5.4.1动物接种试验 取对DHVI型易感的1～7日龄雏鸭5只，皮下或肌肉接种上述滤液，0.2mL/只，另设维鸭接种 生理盐水对照组。接种后分开饲养，随时观察。如果出现特征性的临床症状，并于接毒后18h～48h 出现死亡，通常在24h内死亡。剖检可见DHVI型感染的病变并能从肝脏中重新分离出病毒。 5.4.2鸭（鸡）胚接种试验 将上清液进行系列稀释后，每个稀释度接种于6枚10～14日龄鸭胚或6枚8～10日龄鸡胚的尿囊 腔内，0.2mL/枚，另设鸭胚或鸡胚接种生理盐水对照组。鸭胚于24h～72h后死亡，鸡胚接种后5d～ 8d发生死亡。胚胎的眼观病变为发育阻滞，全身皮下出血，伴有腹部和后肢部的严重水肿。胚肝呈红 2 SN/T3464—2012 黄色肿胀并有坏死灶。死亡时间较长的胚胎中，尿囊液明显变绿，肝脏病变和发育阻滞会更明显。 5.4.3细胞培养分离试验 取14d～17d的鸭胚按常规方法制作原代DEL细胞，于5%CO2培养箱内培养2d长成单层，弃 去营养液，用维持液清洗2次，接种待检样品，0.1mL/10ml，37℃感作1h，待维持液清洗1次后，加 人适量维持液，放入5%CO2培养箱内培养，每天镜检，观察CPE情况。同时设维持液对照瓶。如果含 有DHVI型病毒则能引起CPE，且CPE特征为细胞变圆坏死。如果覆盖一层含1%琼脂糖的维持液 时，CPE能形成直径为1mm的蚀斑。 5.5病毒鉴定 病毒分离物选用电镜观察、中和试验、PCR及荧光PCR等方法进行鉴定，通常用以上一种或多种 方法鉴定DHVI型。 6反转录聚合酶链式反应（RT-PCR） 6.1仪器、材料与试剂 6.1.1仪器 PCR扩增仪、低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析系统、组织匀浆器。 6.1.2材料 0.2mL离心管和吸头（用DEPC水处理后高压灭菌备用，处理方法见附录A，11）。 6.1.3试剂 Trizol、三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇、DEPC水、反转录酶、dNTPs（每种浓度均为10mmol/L）、 5XRT缓冲液、RNA抑制剂RNasin（40U/μL)RNaseA（(20μg/mL）、TaqDNA聚合酶（5U/μL）、琼脂 糖（电泳级）、DNAMarkerDL2000、50XTris-冰乙酸（TAE）电泳缓冲液、溴化乙锭溶液（10mg/mL）、 1%琼脂糖凝胶（见A.12~A.15）。 6.2阳性对照 由指定单位提供或将DHVI标准毒株通过鸭胚传代培养或细胞培养，其培养物经过灭活制备 而成。 6.3阴性对照 由指定单位提供或将健康的鸭胚尿囊液，冻融2～3次，5000r/min离心10min，取上清液备用。 6.4引物 根据GenBank中DHVI的保守基因序列，设计合成一对特异性引物：上游引物5'-ACAATGAC CCAGCCTTAG-3，下游引物5-CCACTGTATCTTCCCTTC-3，使用前用DEPC水溶解成 25pmol/μL，一20℃保存备用。 6.5RNA的提取 取含DHVI毒的鸭胚尿囊液或细胞培养液经8000r/min离心10min后取上清备用；取病变肝 SN/T3464—2012 组织0.5g，按1：10体积比用生理盐水研磨，冻融3次，4℃，8000r/min离心15min，取上清液备用。 参照Trizol法提取，按照试剂说明书进行。取上述样品200μL.加700μl.的Trizol溶液充分振 荡，加200μL三氯甲烷，4℃，12000r/min离心15min，取上清液至少500μL，加异丙醇500μl.充分 混匀.4℃.12000r/min离心15min，弃上清.沉淀用75%的乙醇洗涤，4℃.12000r/min离心 10min；加11μlDEPC水溶解沉淀，一20℃保存备用。或按照市售的RNA抽提试剂盒操作说明提取 病毒RNA。 6.6PCR检测 6.6.1 RT反应 RT反应采用20μL体系见表1 表1RT反应体系 用量 成分 μl 10 mmol/L dNTPs 2. 0 5×RT缓冲液 4. 0 25pmol/μL下游引 2. 0 (40U/μL)RNasinRNA 0. 5 逆转录酶 1. 0 DHV-I RNA 10.5 反应参数设置： 第一阶段，42℃，60mln。 第二阶段，95℃5mi -第三阶段，4℃5min 6.6.2 2PCR反应 PCR反应体系，采用50μL反应体系见表2 表2 PCR反应体系 用量 成分 μl, 10×PCR缓冲液（Mg²+） 5. 0 25pmol/μlL上游引物 1. 0 25pmol/μL下游引物 1. 0 10 mmol/L dNTPs 4. 0 5U/μLTaq酶 1. 0 RT产物 10.0 ddH20水 28.0 SN/T3464—2012 6.6.3扩增程序及反应条件 将PCR反应管置于PCR扩增仪，反应参数设置： 第一阶段，95℃预变性5min。 第二阶段，94℃变性1min、50℃退火1min、72℃延伸1min，共30个循环。 一第三阶段，72℃延伸10