SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3392—2012 国境口岸莱姆病螺旋体检验规程 Codes of examination of Borrelia burgdorferi at frontier port 2012-12-12发布 2013-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 国境口岸莱姆病螺旋体检验规程 SN/T3392-2012 * 中国标准出版社出版 北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013) 北京市西城区三里河北街16号（100045) 总编室：(010)64275323 网址www.spc.net.cn 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张0.75 字数18千字 2014年2月第-版 2014年2月第一次印剧 印数1-1600 书号：155066·2-25389 SN/T 3392—2012 前 言 本标准是按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、军事医学科学院微生物流行病研 究所。 本标准主要起草人：翰文东、孙毅、付维明、杨德文、徐宁、程成、王艳梅、丁淑丽、包力。 SN/T3392—2012 国境口岸莱姆病螺旋体检验规程 1范围 本标准规定了国境口岸莱姆病螺旋体的检验对象、方法、生物安全要求及结果判定。 本标准适用于国境口岸莱姆病螺旋体的检验。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其新版本(包括所有的修改单适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1312国境口岸森林脑炎监测规程 SN/T1638一2005国境口岸莱姆病蓝测规程 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 莱姆病螺旋体Borreliaburgdorferi- 细胞外寄生、微嗜氧型的螺旋体<经蜱传播，是与起人体莱姆病（Lymedisease)的病原体，引起的临 床症状多样，除慢性游走性红斑和关节炎外，还常伴有心脏损害和神经系统受累等症状。 4实验室生物安全防护 检测样本的采集和处理应符合无菌操作原则，进行样本检测的实验室应符合GB19489中生物安 全二级实验室要求。 5对象 5.1疑似感染莱姆病的人出境人员、口岸边境人群的血液样本和其他组织样本。 5.2蜱及宿主动物标本。 6试剂及器材 6.1菜姆病螺旋体培养及聚合酶链反应(PCR)检验试剂和器材参见附录A，或购买符合要求的商品化 检测试剂盒。 6.2血清学检验试剂和器材见SN/T1638--2005中附录A，或购买符合要求的商品化试剂盒。 7标本的采集和处理 按照附录B的方法进行。 SN/T 3392—2012 8实验室检验方法 8.1形态学检验 将染色的玻片置于低倍显微镜载物台上，对准焦距。在涂片上红细胞分散均匀的部分，400倍暗视 野或油镜下耐心仔细按顺序观察，红细胞被染成红褐色，莱姆病螺旋体被染成蓝色，间距约8～10个螺 距，螺距较大。 8.2血清学检验 按照SN/T1638一2005中附录A规定的方法进行，或按照商品化试剂说明书操作。 8.3聚合酶链反应（PCR)检验 参照附录C规定的方法进行。 8.4离体培养鉴定 按附录D规定的方法进行。 9结果判定 9.1形态学检验 9.1.1# 标本中观察到典型的莱姆病螺旋体，报告“观察到莱姆病螺旋体”。 9.1.2标本中300个以上视野，未观察到典型的莱姆病螺旋体，报告“未检出莱姆病螺旋体”。 9.2血清学检验 9.2.1 血清学检验阳性，报告“柴姆病螺旋体抗体阳性”。 9.2.2血清学检验阴性，报告“莱姆病螺旋体抗体阴性”。 9.3聚合酶链反应(PCR)检验 9.3.1PCR检验阳性，报告“莱姆病螺旋体核酸检验阳性”。 9.3.2PCR检验阴性，报告“莱姆病螺旋体核酸检验阴性”。 9.4离体培养鉴定 9.4.1标本中培养出莱姆病螺旋体，报告“离体培养检出莱姆病螺旋体”。 9.4.2盲传三代未见可疑莱姆病螺旋体，报告“离体细胞培养三代，未检出莱姆病螺旋体”。 阳性结果的处置 10 10.1形态学检验和血清学检验阳性的标本，应选择离体分离培养方法进行复检验证。 10. 2 2离体培养阳性结果应出具阳性报告单，升向上级主管部门报告。 2 SN/T3392-2012 附录A （资料性附录） 莱姆病螺旋体检验主要试剂及器材 A.1 主要试剂 A. 1.1 姬姆萨（Gimsa）染液 姬姆萨染料 0.8 g 甘油 50 mL 50 mL 将0.8g染料加到50mL甘油中，混匀，置60℃2h，不时搅拌。取出凉至与室温相同时加入甲醇 50mL，用磁力搅拌过夜。用滤纸过滤，滤液即为原液。应用时用PBS(1/15mol/L，pH6.4～6.8)或蒸 馏水稀释十倍。 A.1.2 培养基的主要成分及制备方法 A.1.2.1 BSKII培养液 (1) CMRL1066（商品培养基） 100mL 高纯水或去离子水定容到 500mL (2) 5.7%明胶（Gelatin)缓冲液 明胶 17. 0 g 高纯水或去离子水定容到 300mL 121℃，15min灭菌。 (3) 300mL蒸馅水，加热至50℃~70℃，依次加人： 新陈Neopetone 5.0 g 胰陈Tryptone 1. 0 g 酵母提取物Yeastolate 1. 0 g 搅拌10min至室温，调pH之前加成分见（4) (4) 依次加人 海培斯HEPES 6.0 g 柠檬酸钠（分析纯） 0.7 g 葡萄糖(分析纯R) 5.0 g 丙酮酸钠（分析纯） 0.8 g N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyglucosamine） 0.4 g 磷酸氢钠（分析纯） 2.2 g 氯化镁MgCl2·6H2O（分析纯） 0.8 g 注：HEPESN-2-hydroxyethylpiperagine-N'-2-ethanesulforicacid为N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸，相对分子质量 238.2。 （5）） 加人35%牛血清白蛋白（BovineserumAlbumin，BSAFractionIV)143mL。 (6） 10mol/LNaOH调pH至7.4。 0.2umL滤膜除菌后总量定容到1L。 3 SN/T 3392—2012 （8）） 取300mL明胶与（7)液700mL混合（或者二者按体积比为3：7混合）。 （9）无菌试验后，加人100mL无菌灭活小牛血清后，低温保存。 A.1.2.2 冻存液（水溶剂，以下为体积百分比） 甘油 28% 山梨醇 3% 氟化钠 0.9% A.1.3PCR试剂 A.1.3.1TRIS-HCI(pH8.8）181.7_g/L_TRIS(三羟甲基氨基甲烷)，浓盐酸（HCI)调整pH值。 A.1.3.2TE缓冲液:10mmol/I↓TRIS-HCI(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。 A.1.3.310×PCR缓冲液：500mmol/L氮化钾（KCl），40mmol/L氮化镁（MgCl²），100mmol/L TRIS-HCl,pH8.5。 A.1.3.4电泳缓冲液：242gTRIS碱，57.1mL冰乙酸，100ml0.5mol/1.EDTA(pH8.0)，加蒸馏水 至1000mL，使用时十倍稀释。 A.1.3.520×SSC缓冲液：在800mL蒸馏水中溶解175.3g氯化钠（NaCI)和88.2g柠檬酸钠，加人 数滴10mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液调节pH值至7.0，加水定容至1L,分装后高压灭菌。 A.1.3.6琼脂糖：电泳级。 A.2器材 A.2.1离体培养器材 5mL康氏管；滤膜滤器；旋泻振荡器离心机；暗视野光学显微镜；解剖显微镜；全排式生物安全 柜；C0)2恒温培养箱；0.22μm除菌滤膜；高压蒸汽灭菌器：玻璃吸管（2ml、5mL）、量简（50ml、 200mL）、三角烧瓶（200mL、1900mL)；电子夫平（精确到0.01g）；普通冰箱。 A.2.2PCR器材 离心机；PCR仪；电泳仪；可调移液器：1L～10μL、2μL ~20L.20μL~200μL100μL~1000μL; 凝胶成像仪。