SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3288—2012 柠檬干枯病菌检疫鉴定方法 Quarantine and identification of Phoma tracheiphila (Petri) L. A. Kantsch.et Gikaschvili 2012-10-23发布 2013-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 柠檬干枯病菌检疫鉴定方法 SN/T 3288—2012 * 中国标准出版社出版 北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013) 北京市西城区三里河北街16号（100045） 总编室：(010)64275323 网址www.spc.net.cn 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张 0.75 字数17千字 2013年4月第一版 2013年4月第一次印刷 印数1-1600 * 书号：155066·2-24686 SN/T3288-2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准参照欧洲地中海植物保护组织EPPOPM7/48（2)"柠檬干枯病菌诊断规程”标准，其图片均 来自采用的规程。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：钟国强、冯黎霞、朱金国、华丽、赵立荣、吴海荣、王其苑、刘海军。 SN/T3288—2012 柠檬干枯病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了柠檬干枯病菌Phomatracheiphila（Petri)L.A.Kantsch.etGikaschvili的检疫鉴定 方法。 本标准适用于来自柠檬干枯病菌发生国家或地区柑橘属寄主（citrusspp.）中柠檬干枯病菌的检疫 鉴定。 2柠檬干枯病菌基本信息 学名Phomatracheiphila(Petri)L.A.Kantsch.etGikaschvili 异名：Deuterophoma tracheiphilaPetri Bakerophoma tracheiphila (Petri) Cif. 英文名：Mavseccodiseaseof citrus 分类地位：半知菌亚门Deuteromycotina，腔孢纲Coelomycetes，球壳孢目Sphaeropsidales，球壳孢 科Sphaeropsidaceae，茎点属Phoma 寄主与分布：参见附录A。 传播途径：病原菌主要通过带有菌丝的果实、带有菌丝及子实体的植株茎干、枝条作远距离传播，其 中产生于植株外表的子实体可用肉眼观察。 3方法原理 病原菌在寄主植株上的症状特点、病原菌形态学特征、培养性状（参见附录B)以及病原菌PCR特 异性检测结果（见附录C)为柠檬干枯病菌的检疫鉴定依据。 4设备和试验用具 4.1仪器设备 体式显微镜、生物显微镜、超净工作台、恒温培养箱、移液器、凝胶成像系统、电泳设备、PCR仪、电 子天平（1/1000g）、高压灭菌锅。 4.2试验用具 刀具、手持放大镜、灭菌培养皿、三角瓶、锻子、手术剪、手术刀、接种针、载玻片、盖玻片等。 5试剂和培养基 5.1试剂 氯化钠（NaCI)、硝酸钠（NaNO）、磷酸二氢钾（KH,PO,）、氮化钾（KCI）、硫酸镁（MgSO，·7H,O)、 1 SN/T3288—2012 硫酸铁（FeSO,）、Tris-HCI缓冲液、EDTA、十二烷硫酸钠（SDS）、蛋白酶K、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、无 水酒精、异丙醇、TE缓冲液、TAE缓冲液。 5.2培养基 PDA培养基：马铃薯200g切碎，加蒸馏水煮熟，用纱布过滤马铃薯，取滤汁加葡萄糖20g、琼脂 17g～20g，加水补足1000mL煮至琼脂完全溶化后，过滤灭菌备用。 滤汁加琼脂15g，加蒸馏水补足至1000mL，高压灭菌备用。 CDA培养基：硝酸钠（NaNO）3g，磷酸二氢钾（KH,PO,）1g，氮化钾（KCI）0.5g，硫酸镁 （MgSO：·7HzO)0.5g，硫酸铁（FeSO,)0.01g，燕糖30g，琼脂15g，蒸馏水1000mL.将以上成分煮 至完全溶化，高压灭菌备用。 6检验方法 6.1现场检验 检查来自于柠檬干枯病菌疫区的寄主植物，尤其是柠檬植物，观察嫩芽或枝条有无褪绿，回枯现象， 用刀具剥开表皮，观察木质部是否有典型的鲑鱼肉色或橙红色症状，选取褪绿、回枯或病斑上有黑点（分 生孢子器）的枝条，带回实验室作进一步检验。抽取柠檬干枯病菌疫区的水果果实回实验室检验。 6.2实验室检验 6.2.1活枝条分离检验 切开枝条表皮，将带有鲑鱼肉色或橙红色症状的嫩枝切成2mm～5mm厚度的小块组织，根据切 块的厚度、大小，表面用0.5%～1%的升汞或50%的酒精消毒40s至2min~5min，灭菌水冲洗，然后 置放在PDA(或CaA、CDA)培养基中，置黑暗中23℃士2℃培养6d～12d。另一方法是将嫩枝切成 5mm10mm厚度，没在灭菌水中30min～60min，取出放在灭菌滤纸上吸干，然后在火焰上快速烧 灼后移至培养基中培养。检验鉴定纯培养物的形态特征、培养形状及分子检测结果。 6.2.2枯菱枝条分离检验 按6.2.1方法对枝条进行表面消毒，将枝条放在装有保湿滤纸的塑料盒中，置黑暗中23℃士2℃ 培养6d12d，如产生分生孢子器，鉴定描述分生孢子器和分生孢子及瓶梗状分生孢子的形态特征。 否则对培养物进行分子检测。 6.2.3果实分离检验 取可疑病果，按6.2.1方法对枝条进行表面消毒并切小块放在上述培养基中培养和检验。 注：分离物在培养基中不产生分生孢子器，只产生瓶梗状分生孢子，如果再次移种，有些分离物也会失去产生瓶梗 状分生孢子的能力。 6.2.4柠檬干枯病菌诊断流程图 见图1。 N SN/T3288—2012 样品 果实 枝条 活枝条 枯萎枝条 PCR检测 保温盒培养 肉眼检查 无分生孢子器 有分生孢子器 分离 纯培养物鉴定 无产孢 有产孢 病原孢子形态检验（分 PCR检测 生孢子器、瓶梗孢子、 芽生孢子) 病原鉴定 图1 柠檬干枯病菌诊断流程图 7检验方法 7.1症状 叶片和枝条首先出现褪绿现象，然后嫩枝末梢和枝条逐渐回枯，剥开表皮，木质部有典型的鲑鱼肉 色或橙红色条纹症状，嫩枝上铅灰色或灰白色的病斑处产生着小黑点，即埋生在组织中的瓶状或球状的 分生孢子器。 3 SN/T3288—2012 7.2病原形态特征 成熟的黑色分生孢子器有孔口，有短颈，直径（60μm～165μm）×（45μm～150μm），孢子器内腔 的分生孢子产孢细胞（瓶梗)产生微小的、单孢单核，有时有双核透明的分生孢子，大小为（0.5um～ 1.5um）×（2μm～4μm），分生孢子可通过孔口逸出为白色粘液；木材表面、受伤的植物组织和木质部 内的气生菌丝长出的瓶梗上可产生一种大的分生孢子，叫做瓶梗孢子，瓶梗大小为（12μm～30μm）× （3μm~6μm）；瓶梗孢子为（1.5μm~3μm）×（3μm~8μm），无色，单孢、单核（有时双核或三核）。 在寄主的木质部导管内以及在液态培养基中，可以产生顶部端圆、直或弯曲的卵状、亚梨形的芽生孢子， 孢子(15μm~17μm）×（7μm~9μm）。 7.3培养性状 在PDA上菌体的最适生长温度为23℃士2℃，生长速率为3.8mm/d～6.0mm/d。菌丝体初为 半透明，几天后转为褐色或粉红色，10d～12.d后产生瓶梗孢子，可用灭菌水制片在显微镜下观察。培 养物若不产生孢子，采用PCR方法检测。 7.4PCR检测 PCR检测步骤及判断标准见附录C。 8结果判定 在检验鉴定过程中，如培养出分生孢子器、瓶梗孢子、芽生孢子等病原菌子实体的，其病害症状、病 原形态特征和培养性状分别符合7.1.7:2和7.3中描述的，鉴定为柠檬干枯病菌。 在检验鉴定过程中，如没有培养出分生孢子器、瓶梗孢子、芽生孢子等病原菌子实体的，其分离出的 纯培养物的培养性状符合7.3中描述，并且PCR检测特异性条带为378bp的（见附录C)，鉴定为柠檬 干枯病菌。 不符合上述两项判定结果的病原菌，鉴定为柠檬干枯病菌阴性结果。 9菌株保存与处理 分离并最终鉴定为柠檬干枯病菌的菌株应转入PDA培养基斜面上，存活后经登记和经手人签字， 置于4℃～8℃黑暗条件下保存，定期（60d)转接，以防止病菌死亡，至少保存6个月。保存期满后高压 灭菌灭活处理。保存好相应的症状文字描述和图片，PCR分子检测实验结果保存电泳图片，以备复核。