NS 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3223—2012 动物传染病PCR检测技术确认规范 Protocolforvalidationof PCRforthe diagnosis of animal infectious/contagious diseases 2012-10-23发布 2013-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3223—2012 前 創言 本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。 本标准修改采用了世界动物卫生组织（OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗手册》2010版中第1.1.4/5章 “传染性疾病诊断方法确认原则和方法”的相关规定。 本标准与OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》2010版第1.1.4/5章“传染性疾病诊断方法确认原 则和方法相比，主要技术差异在于： a）本标准只规定了如何对于非标准方法、实验室设计（制定)的方法、超出其预定范围使用的标准 方法、扩充和修改过的标准方法进行确认，以证实该方法适用于预期的用途，不涉及方法建立 过程和有效性监控； 由于出入境动物检疫工作难以对目标动物群体中某种疾病的流行状况进行估计，对于方法的 b) 诊断敏感性和诊断特异性的评估难以进行，本标准只限于对方法分析特异性和分析敏感性的 评价，不涉及诊断敏感性和诊断特异性。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫 局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、北京市兽药监察所、中国合格评定认可委员会。 本标准主要起草人：马贵平、史喜菊、李冰玲、郭志红、孙颖杰、姜焱、陶雨凤、李炎鑫。 SN/T3223—2012 引言 可靠的检测方法要求与检测领域内的所有国际和国家的法规要求相一致。兽医诊断实验室的认可 活动只有在实验室的所有方法都得到充分确认的前提下才有意义。经过认可的实验室应该可以给出具 有高度再现性的检测结果，但是如果方法确认的过程不恰当，试验结果同样可以对动物的感染状态做出 错误判断。OIE标准阐明，为使一个试验方法被适当应用，方法应被充分确认，这种确认应遵循OIE 《陆生动物诊断试验和疫苗手册》中有关“动物传染病诊断试验确认原则和方法"章节中方法确认的相关 规定进行。方法确认是实验室质量体系的一个组成部分，其过程应该按照实验室质量管理体系的要求 进行。 确认是为了证明方法适用于预期目的。如果方法的预期目的是用于快速筛选受感染动物，方法就 需要有很高的敏感性，以达到尽可能地检测出受感染动物；如果方法的预期目的是用于确诊试验，方法 就需要有高的特异性。如果这两个目标都不能达到，那么就需要对试剂进行校准或替代，或者放弃这种 方法。 Ⅱ SN/T3223—2012 动物传染病PCR检测技术确认规范 1范围 本标准规定了动物传染病PCR检测技术确认要求及分析敏感性、分析特异性、重复性、再现性等方 法性能评价的各要素。 本标准适用于对动物传染病PCR检测技术的确认，也适用于动物产品中传染病病原PCR检测技 术的确认。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T27025检测和校准实验室能力的通用要求（ISO/IEC_17025.2005，IDT） 3术语和定义 GB/T27025中界定的以及下列术语和定义适用于 3. 1 方法确认validation 对一个试验程序（或诊断试验)进行评估.确定该程序或试验与预期目的适合性程度，是试验性能特 征的证明。 3. 2 被分析物analyte 通过分析方法证明或测定的成分，可以是病原或其组分。 3. 3 分析敏感性 analytical sensitivity;ASe 样品中被分析物能够被检测出的最小量，即最低检测限。 3. 4 分析特异性 analytical specificity;ASp 方法能够区别的被分析物与其他成分之间交叉反应的程度。 3.5 重复性repeatability 用同一方法对同一被分析物在相同条件下（设备、操作者、实验室和时间间隔）进行检测所得出的连 续和独立的结果之间的一致性。 3. 6 再现性reproducibility 由不同实验室的操作者用同一方法使用不同设备对同一被分析物进行检测所得出的单次测试结果 之间的一致性。 1 SN/T 3223—2012 3.7 变异系数CV 各个重复的标准偏差与各个重复的平均值之比。 3.8 重复性极限r 小于或等于在重复性条件下得出的两个测试结果之间的绝对差别的值。 3. 9 再现性极限R 小于或等于在再现性条件下得出的两个测试结果之间的绝对差别的值。 3.10 准确性 accuracy 方法检测值与样品真实值之间的符合程度，表示为真阳/阴性率。 4PCR方法确认要素 4.1参考样品 4.1.1参考样品至少要选择三类可以代表被分析物从阴性到阳性浓度范围（即阴性、弱阳性和阳性） 的、确定的样品；阴性参考样品是确定的不含有目标被分析物的阴性对照品，阳性参考样品是具有代表 性的、确定含有目标被分析物的阳性对照品，弱阳性样品可用确定的阴性参考样品稀释得到。 4.1.2参考样品应该能够理想地代表临床样品的真实状态，可以是体外培养的传染性病原或临床样本 等；当这种参考样品难以获得时，可以将已知数量的从体外培养物中获得的被分析物添加到样品中来制 造样品，这种添加样品要尽可能地等同于或者接近于田间样品的真实状态。 4.1.3参考样品要事先通过试验确定其是否能够区分不同数量的被分析物，并对浓度进行优化。对于 荧光PCR，一般要求阳性对照的浓度为产生Ct值为20左右时比较适当；对于普通PCR，一般要求电泳 时目的条带要足够清晰，但亮度不能太强、条带不能过宽以致在紫外光下影响了弱阳性条带的观察。 4.1.4样品的发放方式应该确保可以保存好传染性病原，这些样品应该以冷冻、溶解在有机溶剂（如： Trizol)或者其他方式发放，也可以核酸形式发送（冷冻、冻干或溶解在乙醇里）。 4.1.5要制备和储存足量的参考样品以确保方法确认过程中样品的一致性。 4.2核酸质量评价 4.2.1核酸浓度 核酸浓度（回收率)是评价核酸质量的重要指标之一，回收率对PCR检测的影响是线性的，50%的 回收率最多影响1个Ct；因此，PCR检测对核酸的浓度没有严格的要求，一般需要50ng以上。 DNA样品的浓度（μg/μL）=OD260nm×稀释倍数×50/1000 RNA样品的浓度（μg/μL）=OD260mX稀释倍数X40/1000 4.2.2核酸纯度 核酸纯度（PCR抑制剂去除率）是评价核酸质量的更为重要的指标，纯度对PCR检测的影响是指 数增长的，80%的扩增效率40个循环下来会差6个Ct，所以核酸纯度更为重要。 核酸纯度通过计算OD260nm/OD280mm的比值来评估，一般要求： DNA样品的OD260mm/OD280mm～1.8，大于1.9表明有RNA污染，小于1.6表明有蛋白质、酚等 污染； 2 SN/T3223-2012 RNA样品的OD260mm/OD280m介于1.7~2.0之间，小于1.7表明有蛋白质或酚污染，大于2.0时表 明可能有异硫鼠酸残存。 4.3PCR方法性能特征 4.3.1分析敏感性 4.3.1.1分析敏感性是通过量化样品中被分析物的最小检测量来评估的，可以通过将已知浓度的被分 析物标准品进行有限稀释所获得。 4.3.1.2当缺乏已知浓度的标准品时，可以使用终点稀释法，直到5%以上重复检测不到被检病原体， 此时的稀释浓度就是方法的最低检测限。 4.3.1.3分析敏感性的评估至少要用20份阳性样品，结果表示为平均值加3倍标准差（Mean十3SD）。 4.3.1.4当方法的预期目的是检测微量的被分析物或亚临床感染而有很难获取适当的参考样品（如感 染早期的样品)时，可以确定其相对敏感性，相对敏感性是用其他方法测试相同的样品进行比较。 4.3.1.5当方法的预期目的是要建立更加敏感的检测方法时，应从感染早期开始到疾病爆发阶段采集 一系列样品，并与以前的方法同时进行检测以证明敏感性确实得到了提高。 4.3.1.6同一试验中使用不同的样品基质，敏感性会有很大不同。当建立一个梯度稀释时，最好使用 特性与样品基质相似的稀释液，例如，用阴性精液稀释阳性精液而不是用缓冲液。 4.3.2分析特异性 4.3.2.1分析特异性可以通过分析基因相关的病原体进行评估，也可以从模拟这些基因相关的病原体 感染的动物采取临床样品进行确定。分析特异性主要考虑三个因素：选择性、排他性和涵盖性。 4.3.2.2方法应该具有一定的选择性，酶抑制剂、降解因子等干扰物质的存在以及非特异性结合对分 析特异性造成负面影响，应该尽可能地去除这些影响因素。 4.3.2.3方法特别是确诊方法应该具有严格的排他性，即方法能够检测出目标靶物质，而不能检测出 所有可能发生交叉反应的其他物质。 4.3.2.4排他性的评估可以从感染了基因相关的、但非致病性病原体的动物采取田问样本。当难以获 得田间样本时，可以使用体外培养的病原体。 4.3.2.5方法应该有一定的涵盖性，即能够检测出种内的几种菌/毒株或血清型，或者属内的几个种， 或者密切相关的微生物/抗体中的相似的群。涵盖性能够体现一个筛查方法的应用范围。 4.3.3重复性 4.3.3.1重复性的评估是通过评价组内重复和组间重复来评估的，组内重复性的评估由同一个人来完 成，至少要用3个样