SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3170--2012 葡萄皮尔斯病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Xylella fastidiosa 2012-05-07发布 2012-11-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3170—2012 前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：邓丛良、张凯、高文娜、吕玉峰、梁新苗、刘鹏。 I SN/T3170—2012 葡萄皮尔斯病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了进境植物检疫中葡萄皮尔斯病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于进境植物苗木、繁殖材料和植物产品的葡萄皮尔斯病菌的检疫鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可 是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用手本文件。 SN/T1860植物病毒免疫电镜检测方法 3原理 3.1 葡萄皮尔斯病菌的分类地位 葡萄皮尔斯病菌学名Xylellafastidiosa s7.该菌属原核生物界（Procaryotae），薄壁 菌门（PhylumGracilicutes），木质部小菌属（Xylella）。 3.2检疫鉴定依据 以病菌在寄主上的症状特点、病菌形态学特征及其培养特性病菌种的特征以及基因组序列作为葡 萄皮尔斯病菌的检疫鉴定依据，必要时辅助进行致病性测定（参见附录A） 4 仪器设备、试剂及用具 4.1 仪器、设备、用具 超净工作台、生物培养箱、电子天平、酶标仪、PCR仪、凝胶成像仪、水浴锅、高速冷冻离心机、高压 灭菌锅、透射式电子显微镜、冰箱、液氮罐、解剖刀片、白磁盘保湿盒、研钵、微量移液器（可调式范围： 4.2试剂和培养基 检验所需的药品均为分析纯。 检验中用到的试剂琥珀酸-柠檬酸-磷酸盐缓冲液，其配制方法见附录B。 检验中用到的PD2培养基、CS20培养基、PW培养基、SPW培养基.其配制方法见附录B。 5葡萄皮尔斯病菌的鉴定 5.1双抗体夹心酶联免疫吸附（DAS-ELISA）检测 利用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法对样品进行初筛（见附录C），若检测结果为阳性，需进行病原 1 SN/T3170—2012 菌的分离培养或者PCR方法检测。 5.2葡萄皮尔斯病菌的分离、培养和鉴定 5.2.1葡萄皮尔斯病菌的分离培养 5.2.1.1植物样品叶片中葡萄皮尔斯病菌的分离培养： a）叶片表面用3.0%次氯酸钠溶液消毒10min，然后用无菌水漂洗4次； b）用无菌刀片切下叶片的中脉和叶柄，切出一个2mm～3mm的截面，将汁液划线到PD2或 CS20培养基上（柑橘叶片将汁液划线到PW或者SPW培养基上）； 划线后的平板放在塑料袋中于28℃生物培养箱中培养。 5.2.1.2植物样品根或者茎中葡萄皮尔斯病菌的分离培养： a）取根或茎用5.0%次氯酸钠溶液消毒10min，然后用无菌水漂洗4次； b） 用解剖刀将根或茎切割长为4mm12mm，直径2mm～3mm的小段。然后用琥珀酸-柠檬 酸-磷酸盐缓冲液进行真空渗透； c) 真空渗透提取物（每个样品3mL~4mL）在4500r/min下离心15min； (P 离心后的沉淀用0.8mL的琥珀酸-柠檬酸-磷酸盐缓冲液悬浮，取一滴（5μL）滴到PD2或 CS20培养基上（柑橘用PW或者SPW培养基上）； e 平板在28℃中培养，将平板放在塑料袋中防止培养基干煤。 5.2.2 葡萄皮尔斯病菌的菌落特征 葡萄皮尔斯病菌在28℃培养10d之后可以看到分离的菌落。菌落直径一般为0.5mm～ 2.0mm，圆形，完整的边缘和表面凸起；有时候形成的菌落具有波浪形的边缘，表面扁平。 5.3葡萄皮尔斯病菌的电镜观察 按SN/T1860的规定进行电镜观察。 5.4葡萄皮尔斯病菌PCR检测 用PCR对病原菌进行检测的方法见附录D。 6结果判定 酶联测定为阳性后，经PCR检测待测样品的序列与GenBank中已知的葡萄皮尔斯病菌同源性为 100%或者分离培养性状结合电镜观察为阳性即可判断为葡萄皮尔斯病菌。 7样品保存与复核 7.1样品保存 葡萄皮尔斯病菌为检疫性有害生物，应做好以下准备，并在1周内接受复核。 病菌要有活体样品存在，其他实验样品应妥善保存于4℃冰箱中，以备复核。 7.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和 2 SN/T 3170—2012 实验人员的签字。酶联测定需有酶联检测结果的原始数据，PCR检测需有电泳结果图片。 7.3 3复核 必要时由专家进行复核。 3 SN/T31702012 附录A （资料性附录） 葡萄皮尔斯病菌相关材料 A.1学名 XylellafastidiosaWellsetal.1987木质部难养细菌。 A.2英文名 Pierce's disease(PD)。 A.3分类地位 薄壁菌门（PhylumGracilicutes）本质部小菌凤（Xyilela）木质部难养菌（X.fastidiosa） A.4分布 主要分布于法国、意大利、前南斯 加、加章大、墨西哥、美国、阿根廷、巴西、巴拉 圭、委内瑞拉和南斯拉夫。我国台湾也有报道。 A.5寄主 宽皮橘（松橘）、甜橙（黄果 广橙）、葛苣、垂参属、茜草科等146种植物。 A.6主要症状 侵染葡萄初期沿叶片边缘出现微黄色或红色病斑，后期病斑形 我同心轮纹状，叶片干枯死亡。症状 因品种而异，在黑皮诺和赤霞珠品种上，沿叶片边缘形成规则、边缘逐渐褪色的病斑；在无核白、西万尼 和白诗南品种上，在叶脉间组织形成趣色的病斑。 早秋时叶片干枯脱落，只留下叶柄挂在茎蔓上。 枝条：感病新梢推迟老化成熟，枝蔓表面形成“绿岛”症状的病斑。如果当年没有明显症状，在次年 春天也会出现生长延迟和矮化的现象。 果实：发病果实一般停止生长，逐渐枯萎，有的病果可能提前着色，但并不成熟。在感病第一个季节 末期，通常只有1个～2个枝蔓出现明显病状，随着病情发展逐渐沿蔓扩展向根部发展，整个植株长势 变弱，症状逐渐明显。到了中期，感病枝蔓上的一些或全部枝蔓萎為干枯，枝蔓顶端和根可能全部死亡。 葡萄感病第2年，一些枝蔓或短果枝会不发芽。有的枝蔓从4月末到夏季，可能正常发芽，但全部 新生枝条生长缓慢，新叶叶脉间出现黄化。老叶出现缩，在夏季末，叶片边缘出现灼伤症状，果穗皱缩 干枯。 A.7病原 病原是一种细小的革兰氏阴性细菌，具有数层卷绕的细胞壁和胞外纤维束。电镜下观察该菌为杆 4 SN/T3170—2012 状，大小为（0.25μm~0.5μm）×（1um4μm）单生，无鞭毛，革兰氏染色为阴性，细胞壁波纹状，无芽 孢。具有波纹状细胞壁是这种细菌的典型特征。该细菌兼性好气性，对营养要求苛刻，在琼脂上不能生 长，生长需要血清蛋白或焦磷酸铁等。把感病葡萄的木质部做超薄切片，可见到细菌堵塞维管组织。 A.8 发病条件 温湿的冬季可增大昆虫介体的种群密度，有利于该病害的转播流行。病菌适宜生长温度为26℃～ 28℃，干燥的夏季则有利于病害的发展。 A.9 传播途径 病菌可以通过苗木和昆虫介体进行传播。叶蝉科（Cicadellidae）和 沫蝉科（Cercopidae）中的大多数 昆虫均可作为传播介体。最常见的有红头大叶蝉（CarneocepHalafulgida）、绿叶蝉（DraeculacepHala minerva）、蓝绿叶蝉（GrapHocepHalaatropunctata）亮翅叶蝉（Homalodiscacoagulate），介体可在野生 寄主上吸食和越冬，第2年春天再转移至葡萄，若虫和成虫均具传病能力，通常在病株上吸食带菌后，一 般要经过一个循回期才能传病，有时也能文即传病。野生寄主植物是该病的重要侵染源，不仅提供了大 量的介体昆虫，还可提供大量菌源 S