中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2868—2011 西尼罗病毒病检疫技术规范 Quarantineprotocolforwestnilefever 2011-12-01实施 2011-05-31发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2868—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准参考了国际动物卫生组织（OIE）的《诊断试验和疫苗标准手册》（2008版）（ManualofDiag nosticTestandVaccinesforTerrestrialAnimals)2.1.20章和有关行业标准、文献制定，补充了RT-PCR 和实时荧光RT-PCR的检测方法。 本标准由国家认证认可监督委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫 局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：邱璐、李健、姜焱、熊炜、周晓黎、蒋静、胡永强。 SN/T2868—2011 西尼罗病毒病检疫技术规范 1范围 本标准规定了西尼罗病毒病临床诊断和实验室诊断。 本标准适用于西尼罗病毒病病原及抗体的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3临床诊断 3.1发病症状 人和马感染后，多数不出现症状，部分感染者发生伴有类似流感症状的西尼罗热，少量严重的病例 出现高热、剧烈头痛、颈项强直、昏迷、抽搐等中枢神经系统体症，发生西尼罗脑炎，甚至死亡。 3.2″流行病学 西尼罗病毒（westnilevirus，WNV)为单链RNA病毒，属黄病毒科黄病毒属。病毒呈球形，基因组 编码三种结构蛋白（C、prM和E蛋白）与七种非结构蛋白。西尼罗病毒在抗原性上与同属黄病毒的日 本乙型脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Kuniin病毒、登革病毒相似，在血清学检测时，易产生交叉反应。 西尼罗病毒于1937年首次分离，经蚊媒传播可引起人类或动物的西尼罗热及西尼罗脑炎。鸟类、 马、人等哺乳动物都是易感动物。其中鸟类是主要的储存宿主。 该病在20世纪50年代～90年代都曾有过流行，特别是20世纪90年代以后，流行区呈扩大趋势， 范围遍及非洲、欧洲、中东、西亚、中亚、大洋洲和北美洲等广大地区。目前我国尚无该病流行的报道，但 随着全球气候变暖，疫源地旅行传播以及生物媒介等潜在因素的存在，为西尼罗病毒的传播提供了可 能。加之该病毒目前在我国周边国家如印度、俄罗斯南部、东南亚等国已有报道，我国人群普遍缺乏对 该病毒的免疫力，一旦传人，将导致严重的公共卫生灾难。 4实验室诊断 4.1西尼罗病毒RT-PCR、实时荧光RT-PCR检测及套式PCR检测 4.1.1方法介绍 可以进行西尼罗病毒核酸检测。本标准提供的三种核酸检测方法可以根据具体情况选择采用。 PCR试验的前处理操作可以在BSL-2实验室进行。在对人、活动物或尸体进行取样时，采样人员应佩 戴个人防护设施，穿戴防护衣，佩戴防护口罩、面罩、手套。 1 SN/T2868—2011 4.1.2设备、材料和试剂 4.1.2.1设备、材料 4.1.2.1.1PCR仪。 4.1.2.1.2 实时荧光PCR检测仪。 4.1.2.1.3 电泳仪。 4.1.2.1.4 凝胶成像分析系统。 4.1.2.1.5 高速台式冷冻离心机。 4.1.2.1.6 普通台式离心机。 4.1.2.1.7 匀浆器。 4.1.2.1.8 微量可调移液器。 4.1.2.1.9 无RNase的离心管、吸卖和无RNase的玻璃容器 4.1.2.2 试剂 除特别说明以外，本标准所用 剂均为分析纯，所有试剂均用无 laSe污染的容器（用DEPC水处 理后高压灭菌）分装。试验用水应 合GBTT66S2规定 4.1.2.2.1 裂解液：Trizol或其他 4.1.2.2.2 异丙醇。 4.1.2.2.3 TaqDNA酶。 4.1.2.2.4 75%乙醇：用新开启的的 水乙醇和DE 冷。 4.1.2.2.5 dNTP：含dATP、dTTF dCTP,dGTP 4.1.2.2.6 逆转录酶。 4.1.2.2.7 DEPC水：用DEPC处 4,1,2.2.8 50XTAE缓冲液。 4.1.3 采样、送检和处理 4. 1.3.1 人员样本采集 4.1.3.1.1采集来自于疫区的人员、人境可疑人员、申请检验人员的血液。 4. 1.3. 1.2 2采集怀疑死于西尼罗病人员的血液、脑髓液、组织样品，特别是脑组织和神经组织样品。 4.1.3.2动物及产品样本采集 4.1.3.2.1采集来自疫区的活动物的血清。 4.1.3.2.2 采集来自疫区的疑似感染的动物的脑、脊髓、其他组织样品，特别是神经组织样本。 4.1.3.3禽鸟和蚊虫样本采集 4.1.3.3.1 采集来自疫区的贸易鸟、禽类的血清。 4.1.3.3.2采集迁徒的鸟类血清。 4.1.3.3.3采集来自疫区包装箱内的死鸟、死禽的脑、其他组织样本。 4.1.3.3.4采集来自西尼罗疫区的藏匿于交通工具、运输设备中的蚊虫或以其他方式藏匿的蚊虫样 本。特别是库蚊和饱血蚊虫。 4.1.3.4来自西尼罗病毒病疫区的交通工具、运输设备的样本采集 取样时将棉拭子用无菌PBS浸润后，在面积为5cm×5cm区域内横直各擦拭10次，并不断转 2 SN/T2868—2011 换拭面，然后将拭子棉花端倾入装有pH7.2~7.4PBS液的试管中。 4.1.3.5样本的送检和处理 4.1.3.5.1 采样过程中样本不得交叉污染。样品采集后，放入密闭的塑料袋内，一个采样点的样品， 放一个塑料袋，于保温箱中加冰、密封，送实验室。采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超 过24h；若需长期保存，应放置一70℃冰箱，冻融不超过3次。 4.1.3.5.2血清或血浆：用无菌注射器直接吸取至无菌离心管中，编号备用。 4.1.3.5.3病毒培养物：用无菌滴管直接吸取至无菌离心管中，编号备用。 4.1.3.5.4蚊体、神经或其他组织脏器：取待检样品2.0g置于匀浆器中，加入10mLPBS匀浆，然后 将组织悬液转人离心管中3000r/min离心10min取上清液转入另一无菌离心管中，编号备用。 4.1.3.5.5拭子：将装有拭子的试管在混旋仪上充分混旋提取，挤干拭子，取上清液。试管编号备用。 4.1.4操作步骤 4.1.4.1引物和探针的设计 参见表A.1~表A.3。 4.1.4.2样本核酸提取 4.1.4.2.1在样本制备区进行。取n个灭菌的1.5mL离心管，其中为被检样品数、一份阴性、一份 阳性对照数量之和，对每管进行编号（阳性对照为DNA，无需此步骤）。 4.1.4.2.2每管加人1mL裂解液，然后分别加大4.1.3.5处理后的被检样本、阴性对照、阳性对照各 300μL，一份样本换用一个吸头，再加入200uL三氯甲烷，充分擦荡均匀（如使用旋涡振荡器，避免振荡 过于强烈产生乳化层）。在4℃条件下，12000r/mjm离心15min。 4.1.4.2.3取与4.1.4.2.1中相同数量的1.5mL灭菌的离心管，加入400μL预冷的异丙醇，将上步 离心后样品及对照的上清液500uL转移至相应的各管，避免吸到中间层，盖紧瓶盖，颠倒混均。 一20℃冰箱静置30min。 4.1.4.2.412000/min离心1min，轻轻倒去上清液，每管加500L75%乙醇，颠倒洗涤。 4.1.4.2.512000r/min离心19min，轻轻倒去上清液，吸去残余液体室温下干燥5min。 4.1.4.2.6将抽提的RNA溶解在20-μLDEPC水中待用。 4.1.4.3检测 4.1.4.3.1PCR反应体系 建议的三种PCR检测反应体系参见表A.4表A.6。每个样本设两个平行，每次反应应带阴性、 阳性对照。可以采用两步法进行。 4.1.4.3.2反应参数 4.1.4.3.2.1普通RT-PCR反应参数： 42℃60min;94℃,2min94℃,20s，55℃,20s，72℃，1min，35个循环；72℃,3min； 25℃,15s， 4.1.4.3.2.2荧光RT-PCR反应参数： 42℃60min94℃2min94℃15s50℃15s72℃30s5个循环94℃1558℃40 40个循环（每个循环的第二步搜集荧光）。 4.1.4.3.2.3套式PCR反应参数： 3 SN/T28682011 第一步反应：70℃，10min；45℃，45min；95℃11min95℃.30s55℃，45s.72℃，60s35个 循环72℃，5min；25℃，15s。第二步反应：95℃，30s，55℃，45s，72℃60s，35个循环；72℃ 5min;25℃,15s。 4.1.4.3.3普通RT-PCR和套式PCR产物的电泳检测 将50XTAE稀释成工作浓度，配制1.5%琼脂糖溶液，加热溶解，略为冷却后加人溴化乙锭储备 液，使溴化乙锭的含量为0.5μg/mL，铺板。 取10μLPCR反应产物，加2μL上样缓冲液，进行电泳。根据情况，选择恒定电流或恒定电压模 式，当漠酚蓝迁移至接近凝胶末端三分之二处时，停止电泳。用凝胶成像系统记录结果。若发现条带的 大小与阳性结果一致时，将PCR产物进行测序，再与数据库中序列进行比对。 4.1.5结果判定 4.1.5.1普通RT-PCR结果判定 检测后，如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小扩增条