中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2853—2011 闭合孢子虫病检疫技术规范 Quarantineprotocol formikrocytos mackini 2011-12-01实施 2011-05-31发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 闭合孢子虫病检疫技术规范 SN/T2853-2011 * 中国标准出版社出版 北京复兴门外三里河北街16号 邮政编码：100045 网址www.spc.net.cn 电话：68523946 68517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张1.75 字数49千字 2011年11月第一版 2011年11月第一次印刷 印数1—1600 * 书号：155066·2-22671 SN/T 2853—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准是参考采用OIE的《水生动物疾病诊断手册》（2006版）中2.2.5章《闭合孢子虫感染》（in fectionwithmikrocytosmackini)，对涉及组织学、透射电镜及原位杂交检测的部分内容进行了补充和 完善。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 和中华人民共和国山东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：孔繁德、徐淑菲、刘、陈信忠、龚艳清、王景明、周斌华、徐彪。 SN/T2853-2011 闭合孢子虫病检疫技术规范 1 范围 本标准规定了用于检测牡蛎闭合孢子虫病的临床诊断方法、组织印迹法、组织切片法、透射电镜法、 PCR方法和核酸原位杂交等方法。 本标准适用于牡蛎闭合孢子虫病的流行病学调查、监测、诊断和出入境检验检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3材料和设备 3.1试剂和材料 除另有规定外，下列所用生化试剂均为分析纯。试剂配制方法见附录A。实验用水符合 GB/T6682要求。 3.1.1组织切片制备和染色试剂姬姆萨(Gienfsa)染液、苏木精-伊红染色液、伊红染液、俾斯麦棕Y、 返蓝液：BCIP/NBT；Davidson’液、甲醛！戊二醛、涂有氨基烷基硅烷的载玻片、盖玻片、石蜡、Epson 812、DNP-30、DDSA（十二烷基琥珀酸酐）)、MNA（六甲酸酐）。 3.1.2DNA提取试剂：蛋白酶K、酚-三氯甲烷抽提法所需要的相关试剂或其他DNA抽提试剂盒。 3.1.3PCR试剂：10×PCR缓冲液（不含镁离子）25mmgl/L氯化镁、10mmol/LdNTPs、5U/μL HotstartTag聚合酶、DNAMakerDL2000.6×电泳上样冲液等，购为商品化试剂盒中成分。琼脂 糖5X电泳缓冲液（TBE)。 3.1.4有机试剂：甲醇、无水乙醇、两酮、甘油、异丙醇、二申苯、氧化丙烯、封片树胶和液氮。 3.1.5无机试剂：氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、叠氮钠、醋酸铀、柠檬酸铅和海水。 3.1.6引物及探针：包括一对PCR引物和地高辛标记的核酸探针，均根据SSUrDNA的基因序列 (GenBank：AF477623：该虫大小为1457bp片段的序列)设计 上游引物：5-AGATGGTTAATGAGCCTCC-3（19bp，位置318～336） 下游引物：5-GCGAGGTGCCACAAGGC-3（17bp，位置847863) 该对引物扩增产物大小为546bp。 探针：3"端用地高辛标记的探针序列，序列为5"-AGCCCACAGCCTTCAC-3"-地高辛（16bp，位置 1287~1302)。 3.1.7阴性和阳性对照：由国家质量监督检验检疫总局指定实验室提供。 3.2设备 3.2.1切片机。 3.2.23 组织匀浆研磨器。 SN/T2853—2011 3.2.3PCR仪。 3.2.4扫描电子显微镜。 3.2.5 制冰机。 3.2.6 生物安全柜。 3.2.7 核酸蛋白测定仪。 3.2.8 高压灭菌锅。 3.2.9电泳仪、电泳槽。 3.2.10 旋涡振荡器。 3.2.11 高速离心机、超速离心机。 3.2.12 凝胶成像仪或紫外透射仪。 3.2.13 石蜡包埋模具和电镜包埋模具。 3.2.14 滤器和滤膜（孔径为0.22μm）。 4诊断方法 4.1临床诊断方法 4.1.1临床症状 闭合孢子虫病资料参见附录B。春季发生死亡或口张开的牡蛎，在软组织中（如：外壳、体壁、内收 肌、唇状触须或套膜表面）可观察到含有直径达5mm的黄绿色小脓疱、溃疡或脓肿（参见附录C和附录 D），显微镜观察可见细胞间有红细胞浸润；外壳上经常有褐色伤疤，与双盖在外壳表面的脓肿或溃疡面 相连；在受到损害的组织中心可能会有组织坏死现象，主要为空泡性结缔组织细胞内病灶性感染·常导 致血细胞渗透和组织坏死；由粒状血细胞和透明白细胞组成的脓肿可能含有小细胞，直径1μm～3μm： 除非患有脓疱，不然感染牡蛎通常直到死亡仍然表现良好，有些不表现任何临床特征。 4.1.2结果判定 上述所有这些变化并不是闭合孢子虫病的特异症状，而且部分感染闭合孢子虫病的杜蛎无临床症 状，需进一步通过实验室诊断确诊。 4.2采样 4.2.1采样点的选择 应根据实际情况，一个区域的一个种群至少选取3个采样点，大范围的几块不连续地区养殖易感品 种，应增加采样点。 4.2.2采样技术要求 4.2.2.1有临床症状的牡蛎 挑选死的或可疑的活个体。采样时牡蛎应当是活的，牡蛎应当在活体或杀死后分别包装放在密 封冰藏的容器中送到实验室。所采集的牡蛎应严格避免冰冻。主要采集牡蛎的软组织，包括外壳、内收 肌、唇状触须或套膜表面，尤其含有脓疱的部位。 4.2.2.2 以监测为目的的采样 监测时间应选在一年中最能观察到临床症状并能观察到该虫的温度和季节。样品应包括该地所有 2 SN/T 2853—2011 的易感品种。每次采样的牡蛎数量要以感染率等于或大于2%时检出的概率进行抽样。最常见的情况 是应采集150个以上牡蛎。对无临床症状的牡蛎，取其内收肌或套膜表面等。 4.2.2.3样品保存及运送 采集的样品应在24h内送人实验室，且要附有标签，清楚标明采样时间、地点、来源和养殖历史。 4.3组织印迹法 4.3.1组织样品的选择 主要采集带脓疱的感染晚期的活牡蛎。 4.3.2制片 用手术刀将脓疱组织切成两半，将切面溢出的液体用吸水纸吸干，然后在干净的载玻片表面轻压做 触片，在载玻片上形成薄层膜，自然干燥，丙酮固定印迹5min～10min，用姬姆萨染色（见A.1），染色 5min～10min，流水冲洗，晾于，用1000倍油镜观察。该方法特异性很低，因为该虫与组织印迹的微细 胞很相像。只是出现脓疱时用此法检测的敏感性比传统组织学方法好。 4.3.3结果判定 在宿主细胞外经常可观察到微细胞，由于扭曲变形，其直径大约4μm，而存在其中的闭合孢子虫直 径为2μm～3um，通常有蓝色的细胞质（嗜碱性的)和一个小的红色的细胞核的判为阳性。 4.4组织切片法 4.4.1取样要求和组织切片制作流程 采集濒死或刚死不久的牡蛎。制备组织块包括样品的固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、染色和封片等 一系列步骤。 4.4.2固定组织块 将新鲜组织按照常规制作组织切片的方法制作。即将新鲜的脓疱或内收肌组织等切成1mm左 右的小块，对较大的样品，采用Davidsons液（见A.5)或10%甲醛（见A.6）固定24h。而对较小的样 品，可用3%戊二醛（见A.7)固定，并且它们可兼做电镜样品。也可用海水配制固定液。为了保证有好 的固定效果，固定液和组织块的体积比应为10：1。此时应避免固定时间过长（超过24h）。 4.4.3样品脱水、浸蜡和石蜡包埋 取出固定好的组织块，修整组织块，更换固定液重新固定12h，自来水冲洗.然后按照箭头所指顺序 进行脱水、浸蜡和包埋。70%乙醇1h-→85%乙醇1h→95%乙醇45min→+95%乙醇45min→无水乙醇 4.4.4制备切片 当包埋了组织块的石蜡冷却固化形成蜡块后，用切片机将其切成2μm～3μm厚的薄片。把切片 贴在已经硅化的载玻片上，除去水分并于60℃干燥过夜。在此温度下能去掉剩余的潮气，使切片牢固 附在载玻片上。 3 SN/T2853—2011 4.4.5染色和封片 在染色之前，先将切片在二甲苯或其他毒性相对较小的透明液中浸泡10min以除掉石蜡。重复浸 泡一次后再用无水乙醇浸泡两次，每次10min，然后再在95%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中依次浸泡 2min以除去二甲苯，最后在蒸馏水中浸泡3min重新水化。在进行染色时，按照箭头所指顺序进行.苏 3min→返蓝液（见A.10）2min~5min→自来水5min→蒸馏水5min→85%乙醇2min85火乙醇 2min-→0.5%伊红染液（见A.3）1min~2min→95%乙醇2min→95%乙醇2min无水乙醇2min- 无水乙醇2min→二甲苯2min→二甲苯2min-→封片。 苏木精-伊红染色后，用1000倍油镜观察。细胞核和嗜碱性结构染成蓝色或深紫色，内质网染成蓝 色，细胞质染成灰色。而伊红把其他结构染成粉红色。虽然这种染色只使细胞结构出现很少几种不同 的颜色，但足以检测组织和细胞结构中的任何不正常变化。其他染色技术也可以用来检测某些特殊的 结构或者所特指的特性