中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2850—2011 病毒性出血性败血症检疫技术规范 Quarantine protocol for viral haemorrhagic septicaemia (VHs) 2011-07-01实施 2011-02-25发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2850—2011 前 言 本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。 本标准参考了世界动物卫生组织(OIE)《水生动物病诊断手册2009版》第2.3.9章中病毒性出血 性败血症的方法。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫 局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：高隆英、张利峰、段宏安、史秀杰、徐哗、江育林。 SN/T2850—2011 病毒性出血性败血症检疫技术规范 范围 1 本标准规定了病毒性出血性败血症病毒（viralhaemorrhagicsepticaemiavirus，VHSV）的检测，经 细胞分离到病毒后，用间接荧光抗体试验（IFAT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)及测序等鉴定的检疫规范。 本标准适用于鱼类病毒性出血性败血症的检疫诊断和流行病学调查。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BF-2：蓝鳃太阳鱼细胞系 CPE(cytopathiceffect)：细胞病变效应 DEPC：焦碳酸二乙酯 dNTP(deoxyribonucleosidetriphosphate）：脱氧核糖核苷三磷酸 EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid)：乙二胺四乙酸 EPC:鲤鱼上皮瘤细胞系 FCS(fetalcalfserum）：胎牛血清 HEPES:N-2-羟乙基哌嗪-N"-2-乙磺酸 RTG-2：虹鳟鱼性腺细胞系 RT-PCR(reversetranscription-polymerasechainreaction）：逆转录聚合酶链式反应 Taq酶（TaqDNApolymerase)：TaqDNA聚合酶 Tris[tris(hydroxymethyl)aminomethane]：三（甲基）氨基甲烷 VHSV(ViralHaemorrhagicSepticaemiavirus）：病毒性出血性败血症病毒 4仪器和设备 4.1超净工作台。 4.2生化培养箱。 4.3荧光倒置显微镜。 4.4冷冻离心机。 4.5一80℃超低温冰箱。 SN/T2850—2011 4.6 一20℃普通冰箱。 4.7 磁力搅拌器。 4.8 真空高压过滤器。 4.9 PCR仪。 4. 10 微量移液器及吸头。 4. 11 电泳仪。 4. 12 凝胶成像仪或紫外透射仪。 4. 13 酶标仪。 4.14 剪刀、镊子、离心管、PCR管和细胞培养器皿等耗材。 5试剂和材料 5.1万 水：应符合GB/T6682中一级水的规格，用于-RT-PCR时要用DEPC处理，除去RNA酶。 5.2VHSV参考株：由国家质量监督检验检疫总局指定提供。 5.3抗VHSV的Ig（包被用）：由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供， 5.4抗VHSV的抗血清和包被用Ig不是来源于同一种动物：由国家质量监督检验检疫总局指定单位 提供。 5.5FITC(fluoresceinisothiocyanate）：标记的抗抗体：是抗5.4中所指动物的抗体。 5.6辣根过氧化物酶标记的抗抗体：是抗5.4中所指动物抗体。 5.7细胞生长液：含10%胎牛血清的-199-细胞培养液（含Earles.平衡盐的199培养基配制)（配制见 附录A)。 5.9无水乙醇，分析纯，使用前预冷到一20℃。 5.10反转录酶AMV：-20℃保存，避免温度剧烈变化。 5.11 RNA酶抑制剂：一20℃保存，避免温度剧烈变化。 5. 12 Taq酶：一20℃保存，避免温度剧烈变化。 5.13DNAMarker2000。 5.14琼脂糖。 5.15引物： 正向引物F:5'-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3 反向引物R：5'-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC:C-3 该引物可以扩增VHS病毒日前已知的4个基因型所有毒株的N-基因的505个碱基片段（序列参 见附录B)。 5.16丙酮：分析纯。 5.170.05%吐温-80。 5.18pH8.5甘油生理盐水。 5.195%脱脂奶。 6采样 对有临床症状的鱼（参见附录C)，如果是体长<4cm的鱼苗取整条鱼，4cm≤体长≤6cm的鱼苗 取内脏（包括肾）；体长>6cm的鱼则取脑、肝、肾、脾牌。而对无症状的鱼的采样数量按GB18088的规定 采样。同样要取肾、脾和脑组织，成熟雌鱼还需取卵巢液。 2 SN/T2850—2011 7操作步骤 7.1细胞培养分离VHSV 7.1.1采用的细胞系 BF-2、RTG-2、EPC。BF-2细胞系对淡水分离到的VHSV是高度敏感的。建议同时采用包括BF-2 在内的两种细胞来培养分离病毒。 7.1.2样品处理 将样品置研钵中加入石英砂研磨，随后按1；10的比例将研磨好的组织样悬浮于含有 1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的培养液中，于25℃下悬浮2h～4h或4℃下孵育过夜。 5000g离心15min，收集上清液。 7.1.3接种细胞单层 把已按1：10制备的组织匀浆上清液再作二次10倍稀释（用生长液或维持液稀释均可），即达到 1：100和1：1000组织上清稀释液接种到生长24-h内的长满细胞单层的96孔板。每个样品至少接 种2孔，每孔加0.1mL。试验中要有2孔阳性对照（接种VHSV参考株）和2孔空白对照（未接种病毒 的细胞）。后置于15℃～18℃培养。 每天用显微镜观察CPE，连续观察7_d。如果在7_d.内没有CPE出现，则还要用敏感细胞再盲传一 次。传代程序如下：将接种上述组织上清液的细胞培养物7-d-后冻融收集，5000g，4℃离心15min，离 心后取上清并作1：10和1：100稀释,接种到同种的长满单层的新鲜细胞中，再培养观察7d。 接种了被检匀浆上清稀释液的细胞板或者盲传后的细胞板中出现CPE，应立即取病毒悬液用下述 方法进行鉴定。如果仅有阳性对照出现CPE，样品经过接种细胞和盲传后均没有CPE出现，则结果判 为阴性。 如果阳性对照也未出现CPE则应换用新一批敏感细胞重新进行细胞分离培养。 7.2病毒鉴定 7.2.1间接荧光抗体试验 7.2.1.1在2cm²的塑料细胞培养板孔中或盖玻片上制备细胞单层，通常在22℃孵育24h即可达到 80%长满单层细胞。 7.2.1.2当准备好用作感染的细胞单层后，在传入细胞的当天或第2天，直接将10倍稀释的待鉴定的 病毒悬液接种到细胞培养孔。每个待鉴定的病毒分离物接种6孔。 7.2.1.3按7.2.1.2同样方法稀释并接种VHSV的2孔作阳性对照，其细胞培养液中病毒滴度要达 到5000PFU/mL10000PFU/mL。另2孔只加细胞培养液为阴性对照 7.2.1.4在15℃培养24h。 7.2.1.5孵育结束后，吸出细胞培养液，用0.01mol/LpH7.2的PBS漂洗1次，然后用冷的固定液 （见附录A)快速漂洗3次。 7.2.1.6每2cm²细胞单层用0.5mL固定液固定15min。 7.2.1.8用PBST(见附录A)清洗4次。 7.2.1.9用含0.05%吐温-80，0.01mol/LpH7.2的PBST把抗VHSV的抗血清按说明书稀释到工 3 SN/T2850—2011 作浓度。 7.2.1.10加人抗血清溶液，每2cm²孔加0.25mL。将加入抗血清的细胞单层在37℃湿盒内反应 1 h。 7.2.1.11用上述PBST缓冲液洗4次。 7.2.1.12用FITC标记的抗抗体稀释到工作浓度，每2cm²孔加0.25mL。在37℃下反应1h。该抗 抗体应是对应抗前面所用抗VHSV免疫球蛋白的。 7.2.1.13用PBST缓冲液漂洗4次。 显微镜观察。 7.2.1.15用10倍目镜和较大孔径的20倍～40倍物镜，在荧光显微镜下观察。应在阳性和阴性样品 中看得到预期的结果后才能进行其他样品的观察。阳性反应通常在细胞层上有特异的黄绿色荧光点； 阴性样品只有微弱的绿色背景。 7.2.2酶联免疫吸附试验 0.2mL。包被ELISA微量板。在4℃孵育过夜或者37℃反应1.5h2h。 7.2.2.2用含0.05%吐温-20的0.01mol/L的PBST冲洗4次。 7.2.2.3用5%脱脂奶（200μL/孔）封闭，37℃孵育1h。 7.2.2.4用上述PBST冲洗4次。 7.2.2.5加2%的无离子洗涤剂（TritonX-100或NonidetP-40)到待检的病毒悬液中做2倍或4倍系 列稀释。 7.2.2.6每孔加人100μL经2倍或4倍系列稀释的待检病毒，每个样品2孔。另将已知标准VHS病 毒（阳性对照）、正常组织样品（阴性对照）和细胞培养液（空白对照）也各加2孔。于37℃下和包被好的 抗VHSV抗体反应1h。 7.2.2.7用上述PBST洗4次。 7.2.2.8每孔加0.1mL用细胞培养液稀释到工