SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2702—2010 猪水泡病检疫技术规范 Quarantineprotocol for swine vesiculardisease 2010-11-01发布 2011-05-01实施 中华人民共和国 发布 303 国家质量监督检验检疫总局 数码防伪 SN/T 2702—2010 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准参考了世界动物卫生组织（OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）》 2008版2.8.9章。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫 局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：杨素、沙才华、朱事康、廖秀云、花群义、林志雄、罗琼、徐海聂。 SN/T2702—2010 猪水泡病检疫技术规范 1范围 本标准规定了猪水泡病临床诊断、病毒分离、琼脂扩散试验、反向间接血凝试验、中和试验、单抗阻 断酶联免疫吸附试验、反转录-聚合酶链反应及荧光反转录-聚合酶链反应的操作规程。 本标准适用于进出口动物猪水泡病的检疫 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂（OIE2008版）） 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BSL-3（biologysafetylaboratorylevelⅢ）：生物安全三级实验室 CPE（cytopathiceffect）：致细胞病变作用 Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阅值时所经历的循环数 DEPC：焦碳酸乙二酯 ELISA(enzymelinkedimmunosorb entassay)：酶联免疫吸附试验 FMDV(footandmouthdiseasevirus)：口蹄疫病毒 L-H(lactalbuminhydrolysate)：水解乳蛋白溶液 PCR（polymerasechainreaetion）：聚合酶链式反应 RIHA（reverseindirecthemagglutinationassay：反向间接血凝试验 RT-PCR（RT-polymerasechainreaction）：反转录-聚合酶链反应 SNT(serumneutralizationtest)：中和试验 SVDV(swinevesiculardiseasevirus）：猪水泡病病毒 TCIDso（50%tissuecultureinfectivedose）：半数组织感染量 TTE(1，1,2-trichorotrifluoro-ethane)：1，1,2-三氯三氟乙烷 荧光RT-PCR（fluorogenicreversetranscription-polymerasechainreaction）：荧光反转录-聚合酶链 反应 4临床诊断 猪水泡病的相关资料参见附录A。 猪水泡病病毒（SVDV)属小RNA病毒科，肠道病毒属的单股正链RNA病毒。能够自然感染SVD 病毒的只有猪和人类。SVD潜伏期为2d～7d，发病猪体温急剧上升可达41℃，较少引起死亡。水泡 性损伤是SVD最典型和最具代表性的可视病理变化，损伤多发生在蹄冠部，特别是蹄叉间，并引起蹄壳 1 SN/T2702—2010 松动，甚至脱壳。水泡偶尔会出现在鼻镜部、嘴唇、舌头、背部和乳头，膝部可见浅表溃疡，感染猪跛行及 厌食数天，病猪除口腔、鼻端和蹄部有水泡及水泡破溃后形成溃疡灶外，内脏无明显变化。流产为非典 型症状，神经症状较为少见，仔猪较为敏感。 该病病程需2周～3周，感染猪恢复后在蹄部可见深色的线状痕迹。临床症状因感染猪的年龄、饲 养状况和感染毒株的不同而异，有时呈温和的亚临床感染。本病一年四季均可发生，但多见于冬、春两 季。散养发病率低，集中圈养发病率高；一般不引起死亡。传染源为病猪、康复带毒猪和隐性感染猪，病 畜的水泡皮、水泡液、粪便、血液以及肠道、毒血症期所有组织含有大量病毒。感染猪的肉屑及油水；污 染的圈舍、车辆、工具、饲料及运动场地均是危险的传染源。本病病毒易通过宿主粘膜（消化道、呼吸道 粘膜和眼结膜)和损伤的皮肤感染，孕猪可经胎盘传播给胎儿。受感染猪在出现临床症状前48h开始 通过鼻腔、口腔及排泄物排毒，鼻腔、口腔排毒可持续2周，排泄物排毒可持续3个月。大部分SVDV 在猪感染后1d～7d内繁殖。SVD病毒在pH2.5～12.0范围均较稳定，而FMDV病毒仅在pH6.0~ 8.0范围内稳定。 通过临床症状表现可初步诊断为SVD，但由于SVD与FMD临床症状和病理变化十分相似，临床 上SVD与FMD的鉴别诊断十分困难，应进行实验室诊断。 5实验室诊断 5.1病毒分离 5.1.1i 设备、材料和试剂 本标准所用试剂、玻璃器皿除有特殊规定外，均需高压灭菌。 5.1.1.1 设备 生物安全柜、二氧化碳培养箱、高速冷冻离心机、组织捣碎机、倒置显微镜。 5.1.1.2器材 5mL耐冷冻密封瓶、20mL广口瓶、细胞培养瓶、24孔细胞培养板、50mL离心管、细胞滤网。 5.1.1.3试剂 肝素、75%酒精、50%磷酸缓冲甘油、三氯乙烯、氟利昂、聚乙二醇、氯化钠。本标准所用试剂的配制 见附录B，所用试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。 5.1.1.4细胞 IB-Rs-2传代细胞系或其他敏感猪细胞。 5.1.2样品的采集、保藏和运输 5.1.2.1采样工具 棉拭子、剪刀、镊子、注射器、1.5mL离心管、研钵、真空采血管、记号笔、低温保藏箱或冰盒等采样 工具，应经121℃士2℃，20min高压灭菌并烘干。 5.1.2.2水泡液及水泡皮 用75%酒精消毒水泡皮表面，尽量去除污物，再用灭菌生理盐水擦去酒精，然后用无菌注射器穿刺 水泡吸取水泡液，置于灭菌瓶中，加人抗生素。采取水泡液后，用无菌手术剪将水泡皮剪下，放人 2 SN/T2702—2010 0.04mol/LpH7.4PBS配制的50%甘油缓冲液，加人抗生素。如果水泡已经破溃，用灭菌生理盐水刷 洗掉水泡皮上的污物，然后将水泡皮放入上述甘油缓冲液中，加人抗生素。水泡液及水泡皮均需低温冷 冻或放入冰瓶中送检。 5.1.2.3淋巴结、肌肉及组织脏器 无菌采集待检样品后，编号、冷藏送检或低温保藏。从冻肉中分离病毒，可采集淋巴结，尽量去除周 围脂肪，保存方法同水泡皮。肌肉及组织脏器应装入一次性塑料袋或其他灭菌容器 5.1.2.4全血及血清 用无菌方式采取全血，不少于10mL，并尽快加人抗凝剂和抗生素，密封后保存于4℃。采集发病 动物的全血后，待其康复后再采集一次。 用无菌方式采取全血并分离血清，血清量不少于4mL，加入抗生素，密封后低温冷冻或放人冰瓶中 送检。采集发病动物血清后，待其康复后再采集一次血清。 5.1.2.5口腔分泌物和咽喉拭子 用拭子采取口腔分泌物或将拭子深入口腔内来回刮3次～5次取分泌液，拭子一并放入盛有 1.0mL含抗生素的PBS缓冲液的1.5mL离心管中。也可用食道探杯刮取的咽喉液体，放入加有抗生 素的PBS中。编号，冷藏送检或低温保藏。 5.1.2.6排泄物 采集发病动物排泄物至少20g，置于0.04mol/LpH7.4PBS中，加人抗生素，密封后低温冷冻或 放入冰瓶中送检。 5.1.3样品的处理 5.1.3.1水泡液 无菌采集的新鲜水泡液可不作任何处理，直接使用。若水泡液不清洁，则需1000r/min离心5min~ 10min，并加人抗生素。如果水泡液太少，可加入不含血清的细胞培养液稀释，稀释倍数越少越好。 5.1.3.2水泡皮 用pH7.4PBS漂去水泡皮上的污物，用灭菌滤纸吸干水分，称量后按质量：体积加人4倍不含血 取上清液用于病毒分离。 5.1.3.3淋巴结 淋巴结中的病毒含量较少，需浓缩处理。用pH7.4PBS漂去污物，用灭菌滤纸吸干水分，称量后按 质量：体积加人9倍不含血清的细胞培养液或PBS，加少许石英砂研磨，于4℃浸毒过夜，然后 1000r/min离心5min～10min，取上清液加人2倍体积的预冷的三氯乙烯，充分振荡，1000r/min离 养液，充分悬浮管底，用于病毒分离。如果无超速离心条件，用终浓度8%（质量浓度）的聚乙二醇-6000 和4%（质量浓度）的氯化钠沉淀浓缩组织浸出液中的病毒。首先使其充分搅拌溶解，于4℃过夜，然后 8000r/min离心60min，弃去液相，按原淋巴悬液1/25的量加入不含血清的细胞培养液，充分悬浮管 底，用于病毒分离。 3 SN/T2702—2010 5.1.3.4排泄物 将排泄物置于0.04mol/LpH7.4PBS中，于4℃浸毒过夜，然后10000r/min离心30min，收集 上清液，用于病毒分离。28000r/min离心3h（可浓缩上清液中任何低浓度病毒），弃上清液，用2mL PBS重悬沉淀，加人等量的氟利昂，4000r/min离心10min，取上清用于病毒分离。 5.1.4用细胞分离SVDV 当IB-Rs-2细胞长成单层时，弃去细胞培养液，用不含血清的细胞培养液冲洗细胞单层2次，接种经过 处理的样品（以能淹没细胞单层为宜），于37℃吸附1h，然后补加不含血清的细胞培养液于37℃培养，同 时设立正常细胞对照。每天于倒置显微镜下观察2次，48h进行终判。当正常细胞对照成立，接种样品细 胞出现圆缩、脱落，即为典型的CPE，将细胞冻融2次后离心，取上清液进行进一步鉴定。如果48h内未出